HPLC法测定利咽颗粒中蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱

贺康洪，林 阳，赵文军，侯佳宁

（1. 沈阳军区联勤部药品仪器检验所，辽宁 沈阳 110026； 2. 沈阳军区政治部门诊部，辽宁 沈阳 110000）

利咽颗粒是沈阳军区某医院制剂，用于治疗因风热郁肺、肺胃蕴热所致咽部红肿、咽痛、口干舌燥，干咳少痰有显著疗效。由北豆根、麦冬、天冬、桔梗、甘草等中药组成，其中北豆根为方中君药。北豆根富含生物碱，总生物碱的含量约为1.7%～2.5%，其中脂溶性生物碱蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱（结构式分别见图1）的含量最高，具有抗心律失常、抗高血压、抗肿瘤、镇痛消炎多种药理活性[1－7]，李可强[8]等采用HPLC法测定了北豆根中粉防己碱和青藤碱的含量，但两种成分不能同时测定，操作复杂，覃芳[9]和李广生[10]等进行北豆根指纹图谱研究和北豆根胶囊含量测定时，分别对蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱进行测定，但未见文献报道同时测定中药复方制剂中两种成分的含量，本方拟同时测定该制剂两种成分的含量，从而为制剂质量控制提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Angilent高效液相色谱仪 1100, Chemistatain system工作站（Angilent America），KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，L-200SM 电子分析天平(十万分之一 Shimadzu Corporation Japan)。甲醇、乙腈(色谱纯，Fisher Scientific),三乙胺（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司），水为重蒸馏水。

利咽颗粒(批号 20120120，20120226，20120228，20120531，20120819，20120919，20121112，20121122)购自沈阳军区某医院；蝙蝠葛对照品(批号 111867－201001)和蝙蝠葛苏林碱对照品（面积归一化法测纯度﹥98%），黑龙江省药检所实验室制；药材饮片购自沈阳太原街同仁堂药店。

图1 蝙蝠葛碱（A）和蝙蝠苏林碱（B）结构式Fig.1 The structures of dauricine (A) and daurisoline (B)

1.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：DiamonsilTMC色谱柱(4.6 mm×25018mm，5 m)；流动相A: 0.05%三乙胺水溶液，B: 乙腈，洗脱梯度:0～5 min, 25%～45%B；5～15 min，45%～60%B；15～20 min，60%～80% B；20～25 min，80%～80% B；流速: 1.5 mL·min-1，柱温: 35 ℃；检测波长: 284 nm；进样量: 20 μL。

在拟定的色谱条件下测定，蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱与相邻色谱峰的分离度大于1.5，对称因子均在0.95～1.05之间。阴性样品溶液色谱图显示在蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱出峰位未见其它色谱峰干扰，典型色谱峰图见图2。

1.3 对照品溶液制备

取蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解并定量稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为 44.24 μg·mL-1和 56 μg·mL-1的蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对照品储备溶液。

1.4 线性关系考察

精密量取蝙蝠葛碱对照品储备溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL和蝙蝠葛苏林碱对照品储备溶液1、2、3、4、5 mL，同置10 mL容量瓶中，加为50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件下进样测定。以蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对照品溶液（X:μg·mL-1）)为横坐标,分别与其相应的蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得2种成分的标准曲线回归方程（n = 5）分别为：

结果表明蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱质量浓度分别在1.106～8.848 μg·mL-1、5.6～28 μg·mL-1内与峰面积呈良好线性关系。

1.5 供试品溶液及阴性对照溶液的制备

取利咽颗粒约1.0 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加50%甲醇25 mL，浸泡30 min，称重，超声处理(功率100 W，频率50 kHz) 30 min，放冷，用体积分数为50%甲醇补足减失的重量，滤过，取续液用0.45 μm滤膜滤过即得。

按处方量1 / 10分别称取除北豆根外的其余各味药材，加入10倍量的水浸泡1 h，回流提取1.5 h，滤过；残渣再加入10倍量的水，继续回流提取1 h，滤过，合并煎液，浓缩。用0.45 μm微孔滤膜滤过，制成北豆根阴性对照溶液。

图2 蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱液相色谱图Fig.2 Tipycal chromatograms of dauricine and daurisoline in Liyan granules

1.6 精密度试验

取同一混合对照品溶液,精密量取 20 μL，连续进样6次，结果蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱面积的RSD分别为1.5 %和0.8 %，表明该方法精密度良好。

1.7 稳定性试验

取利咽颗粒样品（产品批号：20120228）约1.0 g，精密称定。按“2.4”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别在0、1、2、4、8、12 h时测定，结果蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱峰面积的 RSD分别为0.7%和1.6%。表明供试品溶液室温放置12 h内基本稳定。

1.8 重复性试验

取批号为20120228的利咽颗粒样品，按“2.4”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件测定，结果蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱含量的RSD分别为2.0 %和1.3 %。表明重复性良好。

1.9 回收率试验

取已知含量的利咽颗粒（产品批号：20120228）9份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入一定量的对照品，按“2.4”项下方法制成低、中、高3个浓度的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果见表1。

表1 利咽颗粒中蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的回收率(n = 9)Table 1 Results of the recoveries of daurieine and daurisoline in Liyan granules ( n = 9 )

1.10 含量测定

取所收集的各批次利咽颗粒，分别按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，按外标一点法计算样品中2种成分的含量，结果见表2。

表2 利咽颗粒中蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱含量测定结果 (μg·g-1，n=3)Table 2 Contents of daurieine and daurisoline in Liyan granules (μg·g-1，n=3)

2 结果与讨论

2.1 供试品溶液制备方法的选择

考察了浸泡超声和加热回流两种提取方式，比较两种方法制备的供试品液中两种成分的峰面积，结果表明回流效率不高，采用浸泡、超声30 min作为最终提取方式。考察了 30%甲醇-水溶液、50%甲醇-水溶液、70%甲醇-水溶液、100%水和 100%甲醇，不同浓度甲醇-水溶液的提取效率，以及用碱调节提取溶剂的pH值，结果表明50%甲醇-水溶液为提取溶剂测得两种待测成分的含量最高。在提取溶剂中加氨水或氨试液制得供试品溶液未检出以上两种成分，表明蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱为非游离生物碱。因此选取50%甲醇-水作为提取溶剂。

2.2 检测波长及洗脱程序的选择

蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的吸收波长分别在284、282和280 nm[8-10]均有报道，本实验也比较了在以上3个吸收波长处待测成分的色谱峰面积，结果相差很小，以284 nm处峰面积最大。考察了等度和梯度两种洗脱方法，结果等度洗脱色谱峰对称性差，尤其是蝙蝠葛碱拖尾严重，因此选择检测波长284 nm，梯度洗脱为最终检测条件。文献[7]报道蝙蝠葛苏林碱见光易分解、不稳定，因此对照品溶液应用时新制，且操作过程中应避光。

3 结 论

建立了测定利咽颗粒中蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱含量的HLPC方法，操作简便，重复性好，可用利咽颗粒中蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱含量的测定。本实验对8个批次利咽颗粒中上述两种成分进行了含量测定，发现各批次的品中蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的含量有差别，但蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的含量均不低于100.0 μg·g-1和200.0μg·g-1。其含量对药效学作用的影响需要进行药效实验来确定。

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