瘤内注射臭氧致兔VX2瘤组织超微结构改变的研究

魏 强， 方 亮， 杨继金， 霍宁宁， 吕 虎， 熊源长， 江 旭， 李 慧

目前，医用臭氧（O3）在国际上已广泛用于创伤或褥疮愈合、外周动脉包括心脑动脉阻塞性疾病、糖尿病足、口腔疾病、病毒性肝炎、化脓性胆管炎、类风湿性关节炎、关节疼痛等辅助治疗，在我国尤其在椎间盘突出症的治疗上取得了非常明显的疗效［1-2］。1980 年，Sweet等［3］在《Science》杂志上报道了臭氧在体外具有抑制人类肿瘤细胞生长的作用，然而近30年来，臭氧在肿瘤治疗方面的研究却很少［4-7］，并且多为臭氧对机体免疫功能调节作用的研究［4，8-10］。2008年 Schulz等［5］报道，通过腹腔内注射臭氧，可以使部分荷瘤新西兰大白兔的VX2瘤完全消失，但这一结果遭到质疑［11］。 张学彬等［6］采用臭氧化碘油经肝动脉灌注栓塞治疗兔VX2瘤，取得了较好的疗效。管京乐和汪蓓蓓［12］通过瘤内直接注射不同浓度臭氧治疗兔VX2瘤，也取得了一定的疗效。本实验旨在通过对兔VX2瘤内直接注入不同浓度臭氧，观察不同时间肿瘤组织超微结构的改变，以判断不同浓度臭氧对肿瘤细胞的杀伤程度。

1 材料与方法

1.1 兔VX2瘤模型制作

取体重2.5～3 kg的新西兰大白兔20只，雌雄不限，由第二军医大学附属长海医院动物实验中心提供。兔VX2瘤株由复旦大学附属中山医院介入放射科惠赠（种植成功的荷瘤大白兔）。以0.03 g/kg戊巴比妥耳缘静脉麻醉成功后，将荷瘤兔仰卧缚于专用手术台上，腹股沟处剪毛，安尔碘消毒后切开皮肤剥离肿瘤，取鱼肉样瘤组织置生理盐水中洗涤2次，剪碎并制成1 mm大小瘤块，接种于实验兔后腿内侧肌肉内，2周后进行实验。

1.2 实验分组及取材

20只兔共分4组，对照组2只，T20（20%臭氧）、T40（40%臭氧）和 T60组（60%臭氧）各 6 只，其中对照组及各治疗组取2只兔在实验完成后即刻取材。方法：按前述静脉麻醉、消毒，直视下切开瘤区皮肤，用游标卡尺测量肿瘤长短经，按照公式V=1/2a×b2计算肿瘤体积［6］，并按肿瘤体积 2倍量不同浓度的O2/O3混合气体用注射器直接注入瘤体内，为减少对肿瘤组织的挤压而引起超微结构改变，即刻处死取材的实验兔均沿肿瘤长径单次穿刺注射，对照组兔仅穿刺肿瘤而不注射气体，沿针道切开肿瘤，取针道周围的瘤组织，置于放有4℃专用固定液（2.5%戊二醛）的硬纸板上，切成0.5 mm大小的组织块，并置于固定液内固定，冷藏备用。T20、T40、T60组各剩余4只兔按肿瘤体积2倍量直视下用注射器多点穿刺注射不同浓度的O2/O3混合气体，以尽量使臭氧弥散到全部肿瘤组织，然后缝合皮肤、消毒，再放入笼内饲养，分别于术后第4、8天各处死2只，按前述方法取材、固定保存。臭氧发生器由德国Humares公司制备。

1.3 制片及电镜观察

将冷藏固定2 h以上的标本用缓冲液漂洗后置1% 四氧化锇中固定2 h，再次漂洗，逐级脱水后，包埋于Epon812中，常规聚合、切片、铀铅染色，置铜网上用Hitachi76透射电镜观察，放大倍数7 500～25 000。

2 结果

电镜观察可见对照组细胞核、细胞膜完整，线粒体较小且少、密度增高，内质网尚完整（图1），部分肿瘤细胞退行性变、坏死。肿瘤内的小血管完整。与对照组相比，T20组注射臭氧后即刻可见肿瘤细胞有轻微损伤，表现为线粒体轻微嵴溶解，少许线粒体呈球状肿胀，内质网扩张，部分核周间隙增宽（图2）。类似改变可以延续至术后第4、8天，但总体改变较轻微，细胞间隙正常。T40组注射臭氧后即刻可见肿瘤细胞有明显损伤改变，表现为线粒体明显肿胀，内质网扩张，细胞核肿胀，核周间隙增宽，部分细胞膜崩裂（图3），组织结构崩解。血管内皮细胞异染色质少。术后第4天，可见大片坏死，肿瘤细胞膜不完整，溶酶体线粒体形成（呈新月形黑颗粒）或线粒体溶解，内质网扩张，部分胞质溶解，细胞核不规则，核周间隙扩张（图4）。术后第8天，仍可看到细胞间隙明显增宽，内质网扩张，线粒体密度增高、形状不规则，提示损伤已部分恢复。T60组注射臭氧后即刻也可见肿瘤细胞有明显的损伤改变，表现为线粒体密度增高，内质网扩张，细胞核肿胀，细胞间隙明显增宽，部分细胞崩解。第4天，组织溶解，细胞分辨不清，可见白细胞浸润（比T40组更明显），炎细胞内可见嗜酸、嗜碱颗粒（图5）。瘤周血管内皮细胞外膜分离，胞质内见空泡变（图6）。第8天，仍然可见大片组织崩解，细胞较分散，线粒体呈球状肿胀，崩解细胞及相对正常细胞溶酶体内有高密度影，内质网明显扩张。

图1 对照组细胞核、细胞膜完整，线粒体较小且少、密度增高，内质网尚完整

图2 T20组注射后即刻少许线粒体呈球状肿胀，内质网扩张，部分核周间隙增宽

图3 T40组注射后即刻线粒体明显肿胀，内质网扩张，细胞核肿胀，核周间隙增宽，细胞膜崩裂

图4 T40组注射后第4天，肿瘤细胞膜不完整，溶酶体线粒体形成（黑颗粒），部分胞质溶解，细胞核不规则，核周间隙扩张

图5 T60组注射后第4天，组织溶解，肿瘤细胞分辨不清，可见白细胞浸润

图6 T60组注射后第4天，瘤周血管内皮细胞外膜分离，胞质内见空泡变

3 讨论

医用臭氧在临床上应用已有100多年，但在肿瘤防治方面的应用研究仅为40余年，且多以离体实验为主，在体研究较少。临床上也仅将臭氧作为辅助治疗手段，从刺激相关细胞因子的合成与释放、提高机体免疫功能角度，达到增强抗肿瘤的效果。事实上，臭氧作为强氧化剂，很容易游离出1个原子氧 （初生态氧），与有机分子反应产生自由基，而使细胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化作用，生成的过氧化脂质及其分解产物丙二醛使蛋白质分子交联，影响酶活性，对细胞膜和细胞器造成损伤，从而直接杀灭肿瘤细胞（与消毒杀灭微生物类似）。目前，有关医用臭氧对髓核组织超微结构的影响已有报道［13］，但对其直接作用于肿瘤组织造成其损伤的形态学改变尚少见报道。

从本研究可见，臭氧对肿瘤细胞具有即刻的损伤、杀灭作用，并且随着浓度的提高而增强。20%臭氧对肿瘤细胞只是造成了比较轻微的损伤，线粒体轻微嵴溶解，少许呈球状肿胀，内质网扩张，部分核周间隙增宽，并未见大片肿瘤坏死，而40%的臭氧则直接对肿瘤细胞产生了明显的损伤，可见线粒体明显肿胀，内质网扩张，细胞核肿胀，核周间隙增宽，部分细胞膜崩裂，组织结构崩解。术后第4天可见肿瘤细胞膜不完整，溶酶体线粒体形成或线粒体溶解，内质网扩张，部分胞质溶解，细胞核不规则，核周间隙扩张，术后第8天仍有类似改变，但逐渐恢复。60%的臭氧对肿瘤造成的损伤较40%更明显，坏死区周围的炎细胞浸润也更明显。以上不同浓度的臭氧对肿瘤细胞超微结构的影响，在术后第8天仍然可见，但与第4天相比已有所减轻，提示正在恢复。除了肿瘤细胞本身外，肿瘤组织内血管内皮细胞也有损伤，表现为胞核内异染色质减少、胞质内空泡形成及细胞外膜分离，这意味着肿瘤内微循环会发生障碍，从而影响肿瘤的营养供应及代谢产物的排出，增加肿瘤组织的坏死。

综上所述，单纯从兔VX2瘤内注射不同浓度臭氧后肿瘤细胞超微结构的改变来看，40%～60%臭氧都可以起到很好的治疗作用，但综合考虑安全性和治疗效果，可能40%臭氧更好一些，因为在我们以往的肝脏动物实验中，观察到在注射高浓度的臭氧时，偶有突然死亡案例发生。另外，如果应用于临床，肯定需要多次、重复治疗，而治疗间隔以4～8 d为宜。

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［12］管京乐，汪蓓蓓.经皮穿刺瘤内注射医用臭氧治疗兔VX2移植瘤实验［J］.安徽医科大学学报， 2010， 45： 777-779.

［13］俞志坚，何晓峰，陈 勇，等.臭氧对髓核超微结构的影响［J］.介入放射学杂志， 2001， 10： 161-163.