转化生长因子-β2诱导的上皮间质转分化对人晶状体上皮细胞基因表型的影响△

徐庆 武静 李贞

引起白内障术后发生后囊膜混浊(posterior capsular opacification，PCO)的因素有很多，包括手术创伤、炎症介质释放、血房水屏障破坏、晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)和皮质残留、人工晶状体的材料、设计及植入位置等［1］。对PCO发生机制的研究［2］结果表明，残留的 LECs增殖、上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和细胞外基质产生是引发PCO的主要原因。迄今为止，诱导发生上述过程的信号因子尚不明确，但在离体PCO模型的研究中发现并证实，多种调控因子参与了PCO的发生过程，包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、成纤维生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等，其中TGF-β在此过程起着至关重要的作用［3-4］。本研究在体外培养的LECs 中，加入100 pg/mL浓度的TGF-β2，诱导其发生EMT，观察转分化的人LECs在形态和基因表型上发生的变化。

1 材料与方法

1.1 材料 MTT试剂盒购于碧云天公司(中国);TGF-β2、人LECs购于ATCC公司(美国);Trizol试剂、SYBR Green I染料、Platinum Taq DNA聚合酶、SuperScript III反转录酶等购于 Invitrogen公司(美国);αB-晶状体蛋白抗体购于Chemicon公司(美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和鉴定 用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5%CO2的细胞培养箱中进行人LECs常规传代培养。免疫组织化学法检测培养细胞中αB-晶状体蛋白表达，主要步骤:磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)漂洗盖玻片上培养的人LECs，室温晾干、丙醛浸泡20 min，PBS漂洗;37℃下用3%H2O2孵育10 min，PBS漂洗;羊血清37℃封闭10 min，加抗人αB-晶状体蛋白抗体，37℃孵育1 h(以PBS代替一抗作为阴性对照);加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗;加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素，37℃孵育30 min，PBS漂洗;DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗;苏木素复染，常规脱水、透明、干燥、封片，光学显微镜(简称光镜)下观察。

1.2.2 噻唑蓝法［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］在96孔板中每孔加入100 μL 2000 个人LECs，不同浓度的 TGF-β2(0、1、3.3、10、33、100、330 pg/mL)处理组各设置 3 个复孔，均处理0、6、24、48 h。每孔加入 20 μL MTT 溶液。在 CO2培养箱中孵育4 h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490 nm处测量各孔的吸光度值(OD值)。以0 pg/mL浓度TGF-β2处理组为对照组，其余各浓度组的测量值为各时间点3个复孔OD值的均数。分别将各浓度组48 h和0 h OD值的均数差与对照组做组间单因素方差分析，并换算成抑制率，选出最佳TGF-β2处理浓度。

1.2.3 最佳浓度TGF-β2处理后对人LECs形态学影响 倒置显微镜观察及拍摄用最佳浓度TGF-β2处理0、6、24、48 h 后的人 LECs照片。

1.2.4 荧光定量RT-PCR法检测mRNA的表达 从经浓度为100 pg/mL 的 TGF-β2 处理 0、6、24、48 h 的人 LECs及空白对照组0、6、24、48 h的人 LECs中抽提RNA。消化离心收集2×106人LECs，用Trizol一步法提取各样品组的总RNA;每组取4 μg总RNA，进行反转录反 应，反 应 体 系:总 RNA 5 μL，oligo dT 引 物(50 μmol/L)0.5 μL，随机引物 0.5 μL，10 mmol/L dNTP 混合液1 μL，DEPC 处理水5 μL，配置得到12 μL混合液Ⅰ，再在混合液Ⅰ的反应体系内加5倍的第一链缓冲液 4 μL，0.1 mol/L dTT 2 μL，RNA 酶 抑 制 剂(40 U/μL)1 μL，反转录酶Ⅲ(200 U/μL)1 μL，混合液I 12 μL配置得到20 μL混合液Ⅱ。反应条件:25℃处理5 min，50℃处理60 min，70℃处理15 min。立即放置到冰上。得到 cDNA，反转录成 cDNA后，取2 μL DNA产物进行荧光定量 PCR。PCR体系:双蒸水12.3 μL，10 倍的 PCR 缓冲液 2 μL，50 mmol/L 的 Mg2+溶液2 μL，10 mmol/L 的 dNTPs 溶液 0.5 μL，20 倍的sybgreen 染料 1 μL，10 μmol/L 的下游引物 0.5 μL，5 U/μL的 Taq 酶 0.2 μL，混合液Ⅱ1 μL。反应条件:预变性95℃ 2 min，变性95℃ 10 s，退火60℃ 30 s，延伸70℃ 45 s，反应进行40个循环。分别检测E-钙粘蛋白(E-cadherin，CDH1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(vimentin，VIM)的 Ct值，并换算成△Ct均数±标准差和相对表达量(2-△Ct)。各基因的引物序列见表1。对照组为actin内参基因。

表1 各基因的引物序列

1.3 统计学处理 所有实验均重复3遍。实验结果采用均数、均数±标准差以及相对表达量表示，所有数据应用SPSS12.0统计软件统计。经单因素方差分析或t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法选择TGF-β2最佳浓度 用不同浓度的TGF-β2(0、1、3.3、10、33、100、330 pg/mL)，分别处理人 LECs 0、6、24、48 h，经 MTT 反应后，测定 490 nm 处的OD值(表2、图1)。结果显示:100 pg/mL的TGF-β2对人LECs的增殖抑制最为明显，抑制率为36.9%，P=0.001(表3)，故选择该浓度作为本实验的TGF-β2最佳处理浓度。

2.2 细胞培养及鉴定 结果显示，光镜下见传代培养人LECs呈多边形上皮样细胞贴壁生长(图2)。用免疫组织化学方法染色见αB-晶状体蛋白在培养细胞中大量表达，表达部位为胞质，证实培养细胞为人LECs(图3)。

表2 MTT反应后各时间点3次测定不同浓度TGF-β2处理人LECs的OD值

图1.细胞活性折线图

表3 不同浓度TGF-β2处理人LECs 48 h后对其增殖的影响

图2.培养人LECs呈多边形上皮样细胞贴壁生长

2.3 TGF-β2处理人LECs后对其形态学的影响 用100 pg/mL 浓度的 TGF-β2 处理人LECs 6、24、48 h 后，细胞形态上拉长，呈梭形，表现出间质细胞样外观(图4)。

图3.光镜下观察αB-晶状体蛋白在培养细胞中表达阳性，表达部位为胞质(×100)

2.4 TGF-β2对人LECs发生EMT时相关基因表达的影响 从经浓度为100 pg/mL的 TGF-β2处理0、6、24、48 h 的人 LECs及空白对照组 0、6、24、48 h 的人LECs中抽提 RNA，反转录，qRT-PCR检测表示，CDH1、α-SMA、VIM以及对照组actin内参基因表达水平的Ct值。

2.4.1 CDH1 结果表明，100 pg/mL TGF-β2 处理人LECs后，随着时间的推移，CDH1相对表达量逐渐下调，48h时达 1.10E-06。和对照组 2.68E-06 相比，表达水平差异有统计学意义(P=0.002)(表4、图5)。

2.4.2 α-SMA 结果表明，100 pg/mL TGF-β2 处理人LECs后，随着时间的推移，α-SMA相对表达量逐渐上升，48 h时达9.21E-03。虽和对照组8.67E-03相比，表达水平差异无统计学意义(P=0.551)，但仍呈上升趋势(表5、图 6)。

图4.100 pg/mL浓度TGF-β2处理6、24、48 h后的人LECs形态照片 A:处理6 h后;B:处理24 h后;C:处理48 h后

表4 100 pg/mL TGF-β2处理人LECs后各时间点测定的CDH1 Ct值、△Ct均数±标准差以及相对表达量

表5 100 pg/mL TGF-β2处理人LECs后各时间点测定的α-SMA Ct值、△Ct均数±标准差以及相对表达量

图5.100 pg/mL TGF-β2处理人LECs后各时间点测定的CDH1相对表达量曲线图

2.4.3 VIM 结果表明，100 pg/mL TGF-β2 处理人LECs后，随着时间的推移，VIM相对表达量逐渐上升，48 h时达1.64E-02和对照组1.37E-02相比，表达水平有显著差异(P=0.006)(表6、图7)。

图6.100 pg/mL TGF-β2处理人LECs后各时间点测定的α-SMA相对表达量曲线图

表6 100pg/mL TGF-β2处理人LECs后各时间点测定的VIM Ct值、△Ct均数±标准差以及相对表达量

图7.100 pg/mL TGF-β2处理人LECs后各时间点测定的VIM相对表达量曲线图

3 讨论

目前认为，PCO主要是一个由多因子参与调控的、残留的LECs发生EMT的过程。届时，上皮源性的LECs在某种特定的条件下，进行一系列的转录和蛋白修饰，使其特有的上皮细胞表型表达受阻遏，如CDH1等表达下降;转而分化为表达间质源性细胞特有表型的间质细胞，如VIM、α-SMA等标志性抗原的表达上调，这使得LECs之间发生分离，失去顶-基极性和移动性增强，从而发生变形、增殖和迁移［5-7］。

Yang等［8］运用培养肾血管上皮细胞做模型进行研究，发现在TGF-β1诱导下，肾血管上皮细胞发生的整个EMT过程需完成4个关键步骤，分别是:上皮细胞失去原有的黏着特性，上皮细胞表达间质细胞的α-SMA和出现肌动蛋白结构重构，基底膜瓦解，转分化的上皮细胞增强了迁移和侵袭能力。

EMT的触发和进展是一个复杂的过程，可能由各种调控因子(如TGF-β、FGF、EGF和PDGF等)经细胞表面的丝-苏氨酸或酪氨酸蛋白激酶受体作用，通过多个互相之间存在有意义串并的路径(包括Wnt、Notch信号通路)，最后激活上皮细胞基因表达下调，间质细胞基因表达上调的转录程序而发动的［6-8］。其中TGF-β在此过程中是最主要的因子。正常情况下TGF-β在人的房水、玻璃体和晶状体中均有表达，以TGF-β2为主，且多以无活性的潜伏型存在，活化后对LECs的生理性分化起着至关重要的作用。TGF-β 3种同源异构体均可诱导LECs发生EMT，而TGF-β2是效价最高的一个亚型，比 TGF-β1 强10 倍以上［9-11］

我们在实验中观察到，在体外培养的人LECs中，加入浓度为100 pg/mL的TGF-β2后，人LECs在形态上拉长，呈梭形(图4)。采用qRt-PCR检测其CDH1、α-SMA、VIM等相关基因的表达，结果发现人LECs出现了间质细胞的表型，即上皮细胞标志性基因CDH1相对表达量24 h后逐渐出现下调，并随着时间的推移越发明显，48 h时为1.10E-06，和对照组2.68E-06相比，差异有统计学意义(P=0.002)(表4、图5)。同时，间质细胞标志性基因VIM相对表达量24 h后逐渐上调，随着时间的推移而明显上升，48 h时达1.64E-02，和对照组1.37E-02 相比，差异有统计学意义(P=0.006)(表6、图7)。α-SMA的相对表达量虽然也逐渐上升，48 h时达9.21E-03，但和对照组8.67E-03相比，差异无统计学意义(P=0.551)，然而48 h后α-SMA似仍有上升趋势(表5、图6)，当然这还需做进一步的实验加以证实。本实验表明，在TGF-β2的诱导下，人LECs发生EMT后，其形态和基因表型均发生与间质细胞相符的变化。

CDH家族是一种同亲型结合、Ca2+依赖的上皮细胞跨膜黏着糖蛋白，其胞外结构域与邻近细胞所表达的CDH相互作用，在建立上皮细胞坚固的黏着力，维持细胞极性和紧密性等方面起着关键作用［12］。不同的细胞及其不同的发育阶段，所表达的CDH的种类与数量均有所不同。E-CDH位于上皮组织;N-CDH在神经元中;P-CDH在胎盘中;T-CDH没有胞质结构域且必须系链到质膜上。E-CDH由胞外结构域5个CDH重复(EC1～EC5)，一个跨膜结构域及一个结合p120连环素和β-连环素的胞内结构域组成。胞内结构域包括一个高度磷酸化的区域，该区域对其与β-连环素的结合，继而对于E-CDH的功能至关重要。上皮细胞中，含E-CDH的细胞间连接经常毗邻含肌动蛋白的细胞骨架的微丝。CDH作为细胞黏附分子家族的一员，不仅维持着上皮细胞的黏附性，而且在细胞增殖和维持细胞极性方面也起着重要的作用［13］。CDH能够抑制细胞间的分离，因此EMT的关键步骤就是下调CDH的作用［14］。E-CDH下调会降低组织内细胞黏附的强度，导致细胞活动性(motility)增加。

在EMT过程中，转分化的上皮细胞中的肌动蛋白细胞骨架的重构以及α-SMA的表达能够形成某种结构基础，使得转分化的上皮细胞不仅在形态学上成为间质细胞［8］，而且能够获得迁移、侵袭甚至收缩的能力。而α-SMA是活化状态的成纤维细胞的一种标志物，实际上这些活化状态的成纤维细胞也被称为肌成纤维细胞［15］，它在形态及功能介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间，拥有收缩及运动功能。

VIM是中间丝中的一种蛋白质，它们与微管及肌动蛋白微细丝共同组成细胞骨架。一个VIM单体有一个中央α螺旋结构域，在前端连着一个非螺旋的氨基，末端连着一个羧基。两个单体会互相扭曲，形成一个卷曲螺管形状的二聚物。两个二聚物会进一步形成一个四聚物，再与其他四聚物相连成为一片。研究发现VIM附在细胞核、内质网及线粒体的旁边或末端，因而相信它在支撑及锚固原生质内的细胞器起着重要的作用。它还能维持细胞的形状、细胞质的完整性及稳定细胞骨架内的相互作用。VIM的动态特性对细胞的灵活性非常重要。在试管压力测试中发现，VIM能提供微管及肌动蛋白所没有的弹性，因此推测它负责维持细胞骨架的完整性。另外，没有VIM的细胞受到微小的针刺时，会出现严重的伤害。在剔除VIM基因的实验老鼠中，虽然它们的动能正常，但微管网却因失去VIM而受损。这加强了微管与VIM之间存在紧密相互作用的假设。再者，当微管解聚物出现时，VIM会发生重组，这表明了两种系统之间存在内在的联系［16-17］。

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