人XPD基因转染对人肝癌细胞的生物学影响*

★ 熊瑛 张吉翔 汤蕾

(1.南昌大学第二附属医院 南昌 330006；2.江西省分子医学重点实验室 南昌 330006)

人XPD基因转染对人肝癌细胞的生物学影响*

★ 熊瑛1张吉翔1**汤蕾2

(1.南昌大学第二附属医院 南昌 330006；2.江西省分子医学重点实验室 南昌 330006)

目的：XPD基因作为TFIIH因子中一员，在基因修复中发挥重大作用。本实验构建带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD，并将其稳定转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞，探讨XPD基因与HBx,Cdk7的相互作用，以及细胞周期和凋亡机制。方法：从人宫颈鳞癌上皮细胞株HeLa细胞克隆出人全长XPD cDNA，构建了pEGFP-N2-XPD重组体质粒，并将其稳定转染入Hep3B并筛选单克隆稳定转染重组质粒Hep3B细胞(Hep3B-pEGFP-N2/XPD)和稳定转染空载质粒Hep3B细胞(Hep3B-pEGFP-N2)。利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达，检测转染XPD基因后细胞内XPD,HBx,Cdk7的表达量变化，并检测细胞的增殖凋亡以及细胞周期变化。结果：(1)利用酶切和基因测序，成功构建了带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD。(2)免疫荧光显微镜下，Hep3B-pEGFP-N2和Hep3B-pEGFP-N2-XPD细胞中可观察到绿色荧光蛋白表达。(3)RT-PCR检测：Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞与Hep3B和Hep3B-pEGFP-N2，两对照组相比,HBx mRNA表达明显降低(P<0.001)XPD mRNA表达明显增高(P<0.01)Cdk7 mRNA表达明显降低(P<0.001)。(4)MTT检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD与两对照相比，细胞增殖率减弱(P<0.05)。TUNEL检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD与两对照组比较，细胞凋亡明显增加(P<0.01)。流式细胞仪检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD进入S期出现障碍，停滞在G0+G1期的细胞增多，细胞凋亡率逐渐增加。(5)Western blot检测Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞中XPD蛋白相对表达量均比两对照组高，Cdk7蛋白相对表达量均比两对照组低，差异有统计学意义(P<0.001).结论：野生型XPD基因片段成功插入pEGFP-N2空载质粒中，将其稳定转染进人肝癌细胞株Hep3B细胞中，可以在转录和蛋白水平提高细胞XPD表达、降低细胞内HBx Cdk7表达。野生型XPD基因过渡表达可能抑制HBx Cdk7表达来改变细胞周期、抑制细胞生长、促使细胞凋亡。

肝脏肿瘤；XPD HBx；CDK7

原发性肝癌的形成是多基因参与下多步骤逐渐演变的过程，其中涉及基因结构、基因表达水平和基因功能等改变。人类XPD基因位于19q13.2-3,编码一个具有ATP依赖的DNA螺旋酶活性的蛋白。[1]XPD蛋白是哺乳动物基本转录因子IIH(transcription factor IIH,TFIIH)复合物的第二大亚基，在核苷酸切除修复过程中，它负责从5'→3'方向打开受损位置的DNA双链，从而允许损伤特异性核酸酶从两侧切下受损DNA，在转录过程中，XPD的作用是维持TFⅡH复合物的结构稳定，并促进转录活性的放大。它的功能受阻可导致突变的基因不能得到有效的修复,同时也会干扰一些调节细胞周期和细胞凋亡因子的功能，从而导致细胞正常生长和凋亡改变。[2]乙肝病毒X蛋白(Heptitise B type X protein ,HBx蛋白)是乙型肝炎病毒HBV合成的蛋白质，是促使肝癌发生的重要因素。HBx对NER的抑制可能是通过包括依赖与非依赖p53的多个途径进行的。[3]细胞周期依赖激酶7(Cycline Dependent Kinase 7 ,Cdk7)在细胞内参与cdk激酶活性的调控，同时也为RNA转录的起始和延长所必需，抑制其功能可能对肿瘤细胞的周期进展产生抑制作用，XPD突变可阻碍Cdk7对某些细胞核受体的磷酸化作用，使细胞对激素的敏感性下降。[4]

笔者克隆了人XPD基因，构建pEGFP-N2-XPD重组表达质粒并将野生型XPD基因稳定转染入人类肝癌细胞Hep3B，并检测XPD,HBx,CDK7表达情况来探讨它们之间的相互作用，并观察转染前后细胞发生的生物学变化。

1 材料与方法

1.1 材料来源

人宫颈鳞癌上皮HeLa细胞以及肝脏肿瘤细胞株Hep3B细胞均来自于美国ATCC,10%FBS(四季青，杭州),DMEM(GIBCOTM，US),培养基10%FBS(GIBCOTM，certified,US),MEM(GIBCOTM，USA),Trizol试剂(Invetrogen,US.),SuperstcriptTM试剂盒(Invetrogen,US.),BglⅡ和KpnⅠTaq酶SphⅠ(TaKaRa公司,Japan),T4DNA连接酶(Promega,US.) ,卡那霉素(TaKaRa公司,Japan),脂质体(lipofectamine 2000TM，Invetrogen,US.) ,G418(Geneticin418, Invetrogen,US),原位细胞凋亡检测试剂盒(Promega,DesdEnd Colorimetric TUNEL System, Promega,US) ECL(Pierce,supersignal)试剂一抗(Santa Cluze,rabbit monoclonal antibody)HRP标记二抗(山羊抗兔抗体，北京金衫)。

1.2 细胞培养

HeLa细胞以及Hep3B细胞，分别在含有10%FBS的DMEM培养基和含有10%FBS的MEM培养基中，37℃，5%CO2的条件下培养，以0.25%胰蛋白酶消化，2-3d传代一次。

1.3 XPD基因克隆，重组质粒构建和扩增

1.3.1 总RNA提取，cDNA合成，全长XPD的PCR扩增

HeLa细胞提取总RNA并逆转路合成cDNA。根据Genebank中公布的人类XPD完整mRNA序列NM_000400.2，设计引物，并在上下游引物的5'端分别加上BglⅡ和KpnⅠ的限制性内切酶位点，引物正义：5′-TTAGAATTCCATGAAGCTCAACGTG-3′，反义：5′-GAGTTAGCGGCTCTGTGTGTAG-3′在Taq酶的作用下,经94℃1min预变性,94℃45s,54℃1min,72℃1min35循环,72℃5min总延伸,扩增出的目的条带长度应为约2300bp。

1.3.2 pEGFP-N2-XPD基因的酶切、连接、鉴定

将带有绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP-N2空载质粒与纯化后的PCR产物分别进行KpnⅠ和BglⅡ的双酶切,二者的酶切产物经电泳纯化并回收后,XPD基因片段和pEGFP-N2载体片段以1-10:1摩尔比例,在T4DNA连接酶的作用下,置4℃16h进行连接反应。得到的连接产物转化感受态大肠杆菌JM-109，在含有终浓度为30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上生长。长出的菌落单个挑出加入LB液体培养基置37℃16h，提取出重组质粒以KpnⅠ、BglⅡ和SphⅠ酶切鉴定，并送上海生物工程有限公司测序。重组质粒命名为pEGFP-N2-XPD。

1.4 质粒转染

实验设3组，分别为肝癌细胞无转染空白对照组Hep3B,空载质粒转染细胞组Hep3B-pEGFP-N2以及重组质粒转染细胞组Hep3B-pEGFP-N2/XPD。Hep3B以2×105细胞/孔的密度铺6孔板内24h细胞铺满50-80%，用1μL质粒进行脂质体介导的转染。转染96h后1：1传代，G418筛选浓度为400μg/mL,挑选抗性细胞克隆种入96孔板中，挑取单克隆集落逐步扩增后传代培养。

1.5 RT-PCR测定基因表达量

提取各组细胞总RNA合成cDNA。根据Genebank中公布的人类XPDmRNA HBxmRNA Cdk7mRNA以及β-actin mRNA序列设计引物。PCR扩增反应条件：94℃预变性4min, 94℃ 40s,退火温度45s,72℃ 50s,30个循环后72℃延伸10min(详见表1)。

表1 XPDmRNA HBxmRNA Cdk7mRNA以及β-actin mRNA引物序列 扩增片段长度以及退火温度

注：2组患者与治疗前比较※P>0.05；2组患者治疗后比较：△P<0.05。

10μL PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳，通过FR200图像分析软件读取目的电泳条带的斑点密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组的XPD、HBx、Cdk7的mRNA表达量，并进行统计学分析。

1.6 细胞凋亡检测

1.6.1 原位细胞凋亡检测TUNEL法

将上述三组细胞分别种植于包被多聚赖氨酸的玻片上培养48h，爬片率约80%，预冷PBS洗涤，新鲜配置4%多聚甲醛固定。按照原位细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，采用凋亡指数(apoptotic index, AI)进行评价。

1.6.2 流式细胞仪检测

收集上述各组处于对数生长期的细胞，无水乙醇4℃固定过夜，Rnase A消化，碘化丙啶染色30min。应用FACSCalibar(Beckton Dickinson ,USA)流式细胞仪，氩离子激光器激发波长为488nm，应用Modifit3.0软件分析结果。

1.6.3 MTT法检测

上述3组细胞于对数期接种于96孔板中，每孔103个细胞，对照组只加培养基,培养24h后每孔加入5mg/mL MTT 10μL,继续培养4h，弃上清，加入100μlDMSO,震荡10min，酶标仪测定492nm处各孔A值，取每孔平均值。计算生长增殖率：生长增殖率=(A实验组/A对照组-1)。

1.7 蛋白表达检测

使用三去污裂解液分别提取3组细胞的总蛋白，使用全自动生化分析仪(Beckman, USA)测定蛋白浓度。取同量蛋白上样于8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，继而转移蛋白于硝酸纤维素膜；膜于5%脱脂奶粉TBST中4℃封闭过夜，加封闭液稀释的一抗1∶500过夜，用TBST洗膜3×15min，加封闭液稀释HRP标记二抗1∶10 004℃过夜，TBST洗膜3×30min，加ECL，X光胶片曝光，洗片。

1.8 统计学处理

数据以均数+标准差表示，方差齐使用卡方检验，方差不齐使用秩和检验，并应用SPSS 12统计软件进行分析。

2 结果

2.1 pEGFP-N2-XPD质粒构建

从HeLa细胞提取的总RNA经RT-PCR后，扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳显示出一条约2 300bp的亮带，符合预期结果。连接产物转化感受态细胞后，提取出的重组质粒分别用KpnⅠ、BglⅡ和SphⅠ三种限制性核酸内切酶进行酶切，选用的pEGFP-N2质粒长度为4737bp, XPD cDNA的PCR扩增产物约为2 300bp,因此重组质粒经KpnⅠ单酶切后电泳应在约7 037bp位置有条带，经KpnⅠ和BglⅡ双酶切后电泳应在4 737bp位置和约2 300bp位置各有一条带。此外，限制性核酸内切酶SphⅠ在pEGFP-N2纯质粒的2 332bp，2 404bp，3 167bp位置和XPD的636bp位置各有一酶切位点，同时XPD是在pEGFP-N2质粒的612bp和652bp之间以正义方向插入，所以重组质粒经SphⅠ单酶切后电泳应包括2 818bp,3 344bp,763bp和72bp的位置的4条带。将构建的pEGFP-N2-XPD送至上海申工检测，获得直接测序报告。

图1-1 Hep3B细胞

图1-2 Hep3B-pEGFP-N2细胞

图1-3 Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞

2.2 质粒的真核表达

pEGFP-N2载体在其多克隆位点后带有绿色荧光蛋白报导基因。通过脂质体转染方式将pEGFP-N2和pEGFP-N2-XPD重组质粒转染入Hep3B细胞48h后，在荧光显微镜下观察到了细胞中绿色荧光蛋白的表达，未转染的纯Hep3B细胞则没有(见图4)。

2.3 pEGFP-N2以及pEGFP-N2-XPD稳定转染成功筛选后各组细胞HBxmRNA,Cdk7mRNA，XPDmRNA及其蛋白表达量的变化。

质粒转染筛选成功后，3组细胞分别进行RT-PCR结果。结果表明，稳定转染野生型XPD后，Hep3B细胞内XPD表达明显增高,HBx,Cdk7表达明显下降。

将曝光后的X光胶片通过通过FR200图像分析软件读取目的条带的测得的激光光密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组的Cdk7,XPD的蛋白表达量，稳定转染野生型XPD后，Hep3B细胞内XPD表达明显增高,CDK7表达明显下降(P<0.01)，而空白对照组以及空质粒转染组则没有显著性差异(P>0.05)(见图2)。

图2

2.4 pEGFP-N2以及pEGFP-N2-XPD转染后细胞凋亡和细胞周期的改变

重组质粒转染组细胞Hep3B-pEGFP-N2-XPD增殖有了明显变化，与空质粒转染组细胞Hep3B-pEGFP-N2和空白对照组细胞Hep3B相比，Hep3B-pEGFP-N2-XPD明显减少。

MTT分析，数据统计处理显示：以Hep3B细胞组生长率为1，Hep3B-pEGFP-N2细胞组为1.041±0.125，Hep3B-pEGFP-N2-XPD细胞组为0.72±0.112，Hep3B-pEGFP-N2-XPD细胞组的吸光度与其他2组比较明显下降，存在显著差异(P<0.05);Hep3B-pEGFP-N2细胞组与Hep3B细胞组相互比较没有显著性差异(P>0.05)。这说明XPD降低了Hep3B细胞代谢，抑制了Hep3B细胞的增殖。

TUNEL法进行凋亡检测发现：Hep3B细胞组Hep3B-pEGFP-N2细胞组凋亡细胞数极少凋亡指数分别为9.12%+1.53%和10.11%+1.41%；Hep3B-pEGFP-N2-XPD细胞组却有大量细胞凋亡，其凋亡指数为26.3%+2.95%。与Hep3B细胞组和Hep3B-pEGFP-N2细胞组相比，Hep3B-pEGFP-N2-XPD细胞组有极显著差异性(P<0.01)(细胞核染棕色为凋亡细胞)。见图3。

流式细胞仪分析，Hep3B空白对照细胞组和Hep3B-pEGFP-N2空质粒转染细胞组G0+G1期分别为52.18和53.00%，S期分别为和35.85%和35.08%,出现代表细胞凋亡的亚G1峰(其面积代表凋亡比例)分别为2.45%和2.52%；Hep3B-pEGFP-N2-XPD重组质粒转染细胞组G0+G1期为69.24%,S期为28.63%，亚G1峰为26.73%。因此Hep3B-pEGFP-N2-XPD重组质粒转染细胞进入S期出现障碍，停滞在G0+G1期的细胞增多，细胞凋亡率逐渐增加(见图4)。

图3 TUNEL法进行凋亡检测

图4

3 讨论

DNA作为一种重要的遗传物质，环境中的各种因素都可能使其结构发生改变从而影响遗传信息的准确传递。因此，各种生物体内都有着一系列DNA修复程序，可以使受损的DNA得以恢复正常。如果某一修复途径中的某个环节发生缺陷，则会导致疾病的发生。[5-6]在着色性干皮病B和可卡恩综合征的病人中XPB基因发生突变，导致DNA修复缺失，从而容易发生癌症。XP，CS和TTD的病人中XPD基因发生突变，导致DNA修复缺失，从而致使癌症发病率是正常人群的数千倍。[7-9]

人类基础转录因子TFⅡH(transcription factor IIH,TFIIH)是一个由九个亚基(XPB,XPD,p62,p52,p44,p34,cdk7,cyclinHT和MAT1)组成的复合体，其中XPB,p62,p52,p44和p34组成一个核心亚复合物，XPD与cdk7,cyclinHT和MAT1组成一个具有CDK活性的激酶(cdk active kinase,CAK)亚复合物。[10]TFⅡH在转录起始和NER中都发挥着重要作用，但XPD亚基在转录和修复中的作用却是不同的。在核苷酸切除修复过程中，它可从5'→3'方向打开受损位置的DNA双链，从而允许损伤特异性核酸酶从两侧切下受损DNA。而在转录起启阶段，XPD的作用是介导CAK锚定在TFⅡH核心亚复物上，并且与P44亚基的N端相互作用，以增强转录活性。有研究发现，XPD突变可阻碍cdk7对某些细胞核受体的磷酸化作用，使细胞对激素的敏感性下降。[11-12]

紫外线照射、吸烟和环境中的各种因素都可以使DNA发生各种损伤，如果这些损伤不能及时被清除并修复，累积将导致疾病的发生(例如肿瘤)。[13]因此，各种涉及DRC的基因如果发生突变，则有可能使肿瘤易感性增强。有研究者通过检测某种基因型细胞的DNA加合物水平(adduct level,AL)来在判断该突变与肿瘤发生危险的关系。[14]XPD某些位点的突变，会降低细胞的NER活性，因此XPD各种基因型也被普遍研究。我们将野生型XPD稳定转染入Hep3B中，通过RT-PCR以及Western Blotting测定，Hep3B细胞是整合了HBx蛋白但不包含抑癌基因P53的人类肝癌细胞。HBx蛋白是乙型肝炎病毒HBV合成的蛋白质，而后者是肝癌发生的重要因素。过去的研究发现，HBx蛋白可以抑制p53序列特异性转录活性，从而破坏p53介导的凋亡、DNA修复和细胞周期。Jaitovich-Groisman I.等在体外和HBx转基因小鼠肝组织中都检测到HBx对XPB和XPD基因转录的抑制，并且，表达HBx的细胞对紫外光和光学致癌剂(如黄曲霉毒素B1)更为敏感。[2]可以推测HBx通过抑制细胞的NER活性，引起大型DNA加合物的堆积，是它的致癌机制之一。虽然XPB和XPD都受p53调控，但无论P53是否存在HBx都对NER产生影响，所以HBx对NER的抑制可能是通过包括依赖与非依赖P53的多个途径进行的。根据目前的研究推测,XPD和HBx作用机制可能主要有以下3条:(1)直接作用:研究显示,HBx蛋白能和许多细胞蛋白相互作用,其中就包括TF ⅡH, XPD作为TF ⅡH的亚单位,参与mRNA转录以及NER。Qadri等的研究指出,无论是体内还是体外实验,HBx蛋白都能和TF ⅡH 结合,进一步的研究还发现,HBx蛋白主要是和TF ⅡH复合体中的XPD/ERCC2, ERCC3亚单位直接结合,主要参与调节DNA解螺旋酶功能。[15]另外,HBx蛋白还能直接刺激XPD的解螺旋酶活性。(2)间接作用:研究显示,HBx蛋白能和单链DNA直接结合,影响单链DNA的解链活性,而已知XPD主要具有解螺旋酶活性,故HBx蛋白通过和单链DNA的结合,改变DNA结构,影响XPD和DNA的结合及发挥其解螺旋酶的活性,从而影响核苷酸切除修复的进行。[16](3)P53介导的作用:P53是一种抑癌基因,有大量研究显示,很多肿瘤(包括肝癌)的发生和P53基因的异常表达有关。研究显示,HBx能和P53直接结合,抑制P53介导的转录活性,抑制P53和XPD间的结合,从而影响核苷酸切除修复。[17]

作为TFIIH激酶亚单位，Cdk7参与了基本转录(通过磷酸化RNA聚合酶2最大亚单位的羧基区域)。作为Cdk活化激酶(CAK)的一分子，Cdk7亦可以磷酸化其他的Cdks,作为他们活化的的一个必须步骤。果蝇属TFIIH成分XPD负性调节Cdk7调节细胞周期的功能(即CAK活性)过量XPD验证CAK活性，导致CDK T 环磷酸化水平的下降，有丝分裂阻滞和细胞死亡，反之，XPD减少会导致CAK活性上升以及细胞增殖。[18-19]此外，在有丝分裂初期XPD水平被调节下降，当CDK1(Cdk7的一个细胞周期靶基因)相当活跃的时候。因此XPD调控下降可能归咎于有丝分裂CAK活性的上调和有丝分裂过程的正性调节。同时，XPD下调可能是基本转录有丝分裂沉默的主要机制。XPB解螺旋酶对于转录是必需的，以打开起始位点附近的启动子，但是XPD解螺旋酶则不是必需的，对于刺激转录和CAK复合物靶定于TFIIH。同时，Cdk7在启动子解开缺失的情况下可以磷酸化RNA pol 2的羧基端区域。[20]Cdk7在细胞内参与Cdk激酶活性的调控，同时也为RNA转录的起始和延长所必需，研究表明，在一些肿瘤组织中Cdk7表达异常增高，化疗后，临床疗效与cdk7表达水平下降一致，[4]因此，我们认为Cdk7可能在肿瘤发病机制中具有关键作用，抑制其功能可能对肿瘤细胞的周期进展产生抑制作用，是一个抗肿瘤药物研发的潜在靶点。用流式细胞术对肿瘤细胞进行细胞周期和凋亡进行分析的结果可以证实沉默Cdk7导致细胞周期阻滞和凋亡，大量细胞阻滞于G0/G1期可能是由到调亡发生的原因。利用投射电子显微镜技术也证明了凋亡的发生。

本研究结果表明：稳定转染野生型XPD后，Hep3B细胞内XPD表达明显增高,HBx,CDK7表达明显下降，细胞增殖力减弱，凋亡增加。目前认为TFIIH调节细胞周期主要通过CAK激酶功能，XPD可以负性调节Cdk7的细胞周期功能及CAK活性，从而影响细胞周期。

本实验只对XPD与相关基因的作用作了初步的探讨。在今后的实验中尚需进一步明确XPD基因与HBx,PUMA,CDKs,P53、P21waf1/cip1和c-Myc的关系以及抑制细胞生长和促使细胞凋亡机制，从而加以纠正；进一步研究XPD基因与HBX的关系，为肝癌及其它恶性实体瘤的综合治疗提供实验依据。

[1]Ueda H, Ullrich SJ, Gangemi JD，et al.Functional inactivation but not structureal mutation of P53 causes liver cancer. Nat.Genet[J]. 1995,9(1):41-47.

[2]Jaitovich-Groisman I, Benlimame N, Slagle BL, et al. Transcriptional regulation of the TFIIH transcription repair components XPB and XPD by the hepatitis B virus x protein in liver cell and transgenic liver tissue [J]. J Biol Chem. 2001,276(17):14 124-14 132.

[3]Prost S, Ford JM, and Taylor C. et al. Hepatitis B x Protein Inhibits p53-dependent DNA Repair in Primary Mouse Hepatocytes [J]. Biol. Chem, 1998，273(50):33 327- 33 332.

[4]Ste?phane Larochelle,Judit Pandur, Cdk7 is essential for mitosis and for in vivo Cdk-activating kinase activity [J]. Gene & Development .1998：12(2):370-381.

[5]Wang XW, Forrester K, Yeh H, et al.Hepatitis B virus X Protein inhibits p53 sequence-specific DNA binding, transcriptional activity, and association with transcription factor ERCC3[J]. Natl. Acad. Sci. 1994,8(91): 2 230-2 234.

[6]Friedberg EC. How Nucleotide Excision Repair Protects Against Cancer.[J]. Nature.2001,(1)：22-23.

[7]Jian Chen, Ste?phane Larochelle, Xiaoming Li .Xpd/Ercc2 regulates CAK activity and mitotic progression [J]. Nature.2003，(424)：22-23.

[8]NiggE. A. Cyclin-dependent protein kinases: Key regulators of the eukaryotic cell cycle[J]. BioEssays .1995，9(17)：17 471-17 480.

[9]Morgan, D. O. Principles of CDK regulation [J]. Nature 1995，374(6518)：131-134 .

[10]Akoulitchev, S. & Reinberg, D. The molecular mechanism of mitotic inhibition of TFIIH is mediated by phosphorylation of CDK7[J]. Genes Dev. 1995，12(22)：3 541-3 550.

[11]Schabath MB, Delclos GL, Grossman HB et al Polymorphisms in XPD exons 10 and 23 and bladder cancer risk.[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005 Apr，14(4):878-84.

[12]Terry MB, Gammon MD, Zhang FF, et al Polymorphism in the DNA repair gene XPD, polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adducts, cigarette smoking, and breast cancer risk.[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004 Dec，13(12):2 053-2 058.

[13]Ishikawa T, Samuel SM Z, Qin XS, et al. DNA repair and cancer: lessons from mutant mouse models [J]. cancer sci. 2004,95(2): 112-117.

[14]许丽,吴一迁，金晏，等. DNA 修复基因XPD 多态性和肝细胞肝癌危险性的病例对照研究 肿瘤，2004，24(6)：526-529.

[15]Tirode F, Busso D, Coin F, et al. Reconstitution of the transcription factor TFIIH: assignment of functions for the three enzymatic subunits, XPB, XPD, and cdk7[J].Mol. Cell.1999,3(1):87-95.

[16]Rybicki BA, Conti DV, Moreira A et al DNA repair gene XRCC1 and XPD polymorphisms and risk of prostate cancer.[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004 Jan，13(1):23-29.

[17]Wang XW, Vermeulen W, Coursen JD, et al. The XPB and XPD helicases are components of the p53-mediated apoptosis pathway[J].Genes & Dev. 1996,10(10):1 219-1 232.

[18]Capovilla A, Arbuthnot P. Nucleotide excision repair by extracts of human fetal hepatocytes [J]. FEBS Letters. 2002,518(1-3):144-148.

[19]JY, Zhou ZY, Judd A, et al. The hepatitis B virus-encoded transcriptional trans-activator hbx appears to be a novel protein serine/threonine kinase [J].Cell 1993 Nov 19，75(4):826.

[20]Capovilla A, Arbuthnot P. Hepatitis B virus X protein does not influence essential steps of nucleotide excision repair effected by human liver extracts [J]. Biochemical and Biophysical Communications. 2003,312(3):806-810.

BiologicalAlterationofHepatomaCellsTransfectedbyXPBinVitro*

XIONGYing,ZHANGJi-xiang**,TANGLei

1.ThekeylaboratoryofmolecularmedicineofJiangxiprovince,JiangxiNanchang330006;2.ThesecondaffiliatedhospitalofNanchangUniversity,JiangxiNanchang330006

Background & Objective:As a part of TFIIH ,XPD gene plays a key role in NER. To construct the recombinant plasmid pEGFP-N2-XPD and transfect the plasmid into the human hepatoma carcinoma cell line Hep3B. To investigate the role of wild-type XPD in cell cycle and apoptosis of hepatoma cells and its relationship with HBx and Cdk7.Methods:The human full length XPD was cloned by RT-PCR using the total RNA extracted from HeLa, and was inserted into the pEGFP-N2 plasmid vector which expression the green fluorescence protein(GFP). And then pEGFP-N2 and pEGFP-N2-XPD were transfected into Hep3B cell line by LipofectAMINE 2000 and selected in medium containing G418,400μg·mL-1for Hep3B-pEGFP-N2 and Hep3B-pEGFP-N2-XPD; Cell lines for comparison were matched on the same genetic background and passage . The expression of wild-type XPD、HBx and Cdk7 were detected by RT-PCR and Western blot, cell growth was detected by MTT, TUNEL and FCM were employed for examining the cell cycle and apoptosis of the transfected Hep3B cells. Results:1.We have built the combinational plasmid pEGFP-N2-XPD . 2. Hep3B-pEGFP-N2 and Hep3B-pEGFP-N2-XPD express the green fluorescence protein(GFP) which could be detected under the immunofluorescence microscope. 3.The relative expressin of HBx mRNA in Hep3B, Hep3B-pEGFP-N2 and Hep3B-pEGFP-N2-XPD were：0.361±0.095、0.368±0.098、0.113±0.041； The relative expression of HBx mRNA in Hep3B-pEGFP-N2-XPD was significantly lower than the control Hep3B、Hep3B-pEGFP-N2. 4.The relative expression of XPD mRNA in the three cell lines were 0.635±0.095、0.233±0.090、0.209±0.098,respectively,those in Hep3B-pEGFP-N2-XPD was significantly higher in compared with the controls ,the difference was statistically significant(P<0.01). 5.The relative expression of Cdk7 mRNA in the three cell lines was 0.753±0.054 、0.816±0.053 、0.122±0.049 respectively,those in Hep3B-pEGFP-N2-XPD significantly lower than the two controls (P<0.001). 6.MTT's result shows that the proliferative ability of Hep3B-pEGFP-N2-XPD is much more decreased.Wild type XPD gene could change the cell cycle and induce apoptitise in vitro though the results of TUNEL and FCM. 7. Western blotting: the relative expressin of XPD protein in Hep3B, Hep3B-pEGFP-N2 and Hep3B-pEGFP-N2-XPD was ：0.408±0.049、0.467±0.088 、0.782±0.108; the relative expressin of Cdk7 protein in the three cell group was: 0.114±0.074、0.112±0.037 、0.754±0.059. Compared with the two controls, those in Hep3B-pEGFP-N2-XPD was less with a significant difference (P<0.001).Conclusion Wild-type XPD could decrease the expression of HBx and Cdk7 and inhibit the activity of cell growth ,as well as change cell cycle and induce cell apoptosis in hepatoma cell line Hep3B in vitro.

Hepatoma XPD;Clone HBx;CDK7

国家自然科学基金资助项目(项目编号：30360037)。

**通讯作者：张吉翔,Tel：0791-86292706,E-mail:jixiangz@tom.com。

R735.7

A

2013-10-12)