针刺对大鼠颅脑损伤后Nogo-A表达的实验研究

田贵华，王锡友，姚海江，李志刚

（1.北京中医药大学东直门医院推拿科,北京 100029；2.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029）

现代医学研究发现，影响颅脑损伤（CCI）后中枢神经修复的因素主要包括神经营养因子（NTF）缺乏、轴突生长抑制因子和轴突导向因子等[1-4]。轴突生长抑制因子是目前颅脑损伤研究的热点之一[5]。

Nogo-A作为轴突生长抑制因子Nogo的异构体之一，其对轴突再生的抑制作用最强。本实验采用针刺颅脑损伤大鼠督脉上的“百会”、“人中”两穴进行干预治疗，运用免疫组化方法对各组大鼠脑组织轴突再生抑制因子nogo-A的蛋白表达含量进行检测，分析针刺对颅脑损伤大鼠损伤脑组织轴突再生抑制因子nogo-A蛋白表达的影响，从而对针刺治疗颅脑损伤的机制进行研究分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠（由中国医学科学院实验动物中心提供），180只，体质量250~280 g。适应环境3 d后进入实验，适应期间采用12 h明/暗周期（早 7∶00~晚 7∶00）照明，自由饮水进食。根采用随机数字表法将大鼠随机分为3组，即电针组、模型对照组、正常对照组，每组60只，然后再将每组随机分成 6h、1d、6d、12d，4 个时间组，每个时间组12只。

1.1.2 针具 用华佗牌无菌针灸针，规格为0.30mm×13 mm。电针采用用韩氏（HANS）电针仪，型号为LH-402H，由北京大学医学部神经科学研究所监制。

1.2 方法

1.2.1 颅脑损伤模型制备 参照Feeney等研制的鼠颅脑创伤模具进行改进设计打击装置,对模型组和针刺组大鼠造成左顶叶局限性脑挫裂伤。术前大鼠禁食8 h，经40%氟烷诱导麻醉后称体质量，然后腹腔注射浓度为10 g/L的戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，麻醉成功后俯卧位固定。用8%Na2S清除手术部位鼠毛并消毒皮肤，正中切开，剥离骨膜，暴露左顶骨，用牙科钻在冠状缝后1.5 mm，中线旁2.5 mm处钻一直径5 mm骨窗，保持硬膜完整。将撞杆置于硬膜上，用20 g砝码置于30 cm高处沿外周导管坠落，撞击撞杆从而撞击硬膜，造成中度颅脑损伤。按神经功能损伤程度评分（NSS）简易准则评估，分值为4~6者属中度损伤，提示造模成功。打击后切口内滴注4万单位硫酸庆大霉素4~5滴，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。正常对照组不予处理[6]。

1.2.2 行为学观察 各组手术后，分别于6h、1d、6d、12 d进行行为学观察。参照NSS制定简易评估准则得分越高，说明颅脑损伤越重。神经损伤伤情共包括10项，提尾时后腿屈曲、不能在地上直线行走、翻正反射（righting reflex）消失、肢体位置反射（placing reflex）消失、惊吓反射消失、无寻觅行为、俯卧、不能完全伸直其前肢、木条平衡作业少于60秒（1cm宽）、不能在4 cm宽木条上行走，每项各1分，共10分。

1.2.3 治疗方法 于造模后即刻以1寸（同身寸，下同）毫针针刺“人中”、“百会”两穴，将针柄分别连接至电针仪的电极上，“百会”穴接阴极，“人中”穴接阳极，持续脉冲电流，频率2 Hz，强度2 mA，时间为30 min。正常组和模型组在治疗时间均要抓取1次，以保证和针刺组大鼠的条件相同。电针组中的各时间点组于每天同一时间点治疗1次。

1.2.4 标本制备 各时间点组（6h、1d、6d、12d）大鼠分别于手术后6 h、1 d、6 d、12 d断头处死，在冰片上迅速取出损伤部位脑组织，然后用-4℃的生理盐水冲洗干净后置冻存管，迅速投入液氮保存待测。

1.2.5 免疫组化 石蜡切片经常规脱蜡处理后，3%H2O2避光浸泡30 min，枸椽酸缓冲液行抗原修复。3%正常兔血清37℃孵育30 min，羊抗人在37℃孵育2 h或孵育30 min后放入4℃冰箱过夜；生物素标记的兔抗羊IgG 37℃孵育30 min；辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液。37℃孵育30 min后DAB显色试剂盒显色。苏木精复染。常规脱水，透明，封片[6]。

1.3 图像处理和统计学分析 采用ipp6.1图像分析系统，各组每只大鼠取5张切片，随机视野中阳性反应细胞测其灰度值，每张片随机取5个视野，取其均值作为每一例的平均灰度。统计分析采用SPSS 18.0软件。计量资料以均值±标准差（±s）表示。3组之间整体比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 Nogo-A蛋白表达图像分析结果 见表1。

表1 颅脑组织中Nogo-A蛋白表达图像分析结果（±s）Tab.1 The image analysis results of the protein expression of Nogo-A in craniocerebral tissue（±s）

表1 颅脑组织中Nogo-A蛋白表达图像分析结果（±s）Tab.1 The image analysis results of the protein expression of Nogo-A in craniocerebral tissue（±s）

注：与模型组比较*P<0.05,**P<0.01，与空白组比较#P<0.05，##P<0.01。

组别 n 6 h n 24 h n 48 h 6 d模型组 10 213.973±57.640 10 258.583±42.047 9 541.796±186.832 530.758±159.812空白组 11 164.366±17.005** 11 164.366±17.005* 11 164.366±17.005** 164.366±17.005**电针组 09 640.991±144.238**## 11 368.708±53.727**## 10 333.170±90.058**## 213.428±54.840**

2.2 免疫组化结果 见图1。

3 讨论

中医学认为颅脑损伤的病机为气机逆乱气滞、经络阻滞，主要病理因素为水停、瘀血、痰湿，各因素互为因果从而造成患者神志、语言及运动等方面的障碍。治疗原则为活血化瘀、化痰开窍、疏通经络。“百会”、“人中”为督脉之要穴，“百会”为足太阳经、手足少阳经、足厥阴经与督脉之会，能升清化瘀，有助于瘀血的消散和吸收，更可补神益智，疏通脑络。“人中”是手、足阳明经与督脉之会，为危急病症的常用针刺急救穴位，可明显地促进脑血循环，增加脑灌注量，改善微循环障碍。督脉电针，不但可以调节督脉经气、疏通气血，还是一种脉冲电场，具有针刺和电场双重作用。临床实践及实验证明[1-2]电针能促进CCI后神经功能的恢复。

中枢神经系统（CNS）损伤后产生的大量轴突生长抑制因子，是阻碍CNS再生的重要原因。它具有3种主要异构体，分别是Nogo-A,Nogo-B和Nogo-C，其中以Nogo-A与神经再生的关系最为密切，是作用最强烈的神经再生抑制物质[7]。Nogo-A在大鼠生长发育阶段表达明显，在神经发展成熟后，其在脑内呈低水平表达，当神经组织损伤重建时，Nogo-A的表达可再次增强[8-10]。研究表明,脑组织内Nogo-A的表达量在颅脑损伤后的早期即发生改变，这一变化伴随急性颅脑损伤的整个过程，并且与颅脑损伤的轻重程度以及损伤后神经功能恢复的好坏密切相关。Nogo-A作为中枢神经轴突生长抑制因子最为重要的一个,也是反映急性颅脑损伤后脑组织病理改变的敏感指标。本实验观察到，在正常成年大鼠（空白组）颅脑细胞中，Nogo-A蛋白表达较低，颅脑损伤后的6 h、24 h、48 h和6d Nogo-A蛋白表达显著升高，炎性细胞开始在损伤周围浸润。此时损伤位点上方前角运动神经元中Nogo-A蛋白表达明显增加，而针刺组6 h显著升高，从24 h开始，Nogo-A表达逐渐开始下降，48 h、6 d时，Nogo-A蛋白的表达都显著低于模型组。这提示，电针治疗对大鼠脊髓损伤后Nogo-A蛋白表达具有明显的抑制作用。电针促进颅脑损伤大鼠神经修复的机制可能涉及很多方面，依据本实验结果，可以证实下调Nogo-A蛋白表达，促进神经再生可能是其重要机制之一。

[1]李志刚,刘书坤.近十年电针治疗脊髓损伤的临床和实验研究概况[J].中国中医药科技2004,11(6):386-388.

[2]韩清民,谢杰,柴生颤,等.电针督脉对实验性脊髓损伤大鼠水通道蛋白-4的影响[J].中国中西医结合杂志,2005,7(25):637-639.

[3]Wang K H,Brose K,Arnott D,et al.Biochemical purification of amammalian slit protein as a positive regulator of sensory axonelongation and branching[J].Cell,1999:771-784.

[4]孙 青,田国庆.糖尿病脑病发病机制及药物干预概况[J].中华中医药杂志,2009,24(4):502-505.

[5]Juri R,Matthias M.What does it mean to identify a protein in proteomics Trends in Biochemical Sciences[J].2002,27(2):74.

[6]田贵华,谭纯,姚海江,等.针刺对大鼠颅脑损伤后轴突导向因子Slit2表达的影响[J].中华中医药杂志,2011,26（5）:1197-1200.

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[10]Schwab ME,Mir A,Rouiller E,et al.Intrathecally infused antibodies against Nogo-A penetrate the CNS and downregulate the endogenous neurite growth inhibitor Nogo-A[J].Mol Cell Neurosci,2006,32:161-173.

图1 3组不同时间免疫组化结果Fig.1 The results of immunohistoche mistry at different time among 3 groups