CIP2A、β-catenin和C-myc在慢性粒细胞白血病中的表达及意义

王石松

CIP2A、β-catenin和C-myc在慢性粒细胞白血病中的表达及意义

王石松

目的探讨蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)在慢性粒细胞白血病(CML)中的表达及意义。方法采用免疫组织化学SP法同时测定CIP2A、β-catenin和C-myc在对照组和CML各期中的表达,并分析CIP2A、β-catenin和C-myc表达的关系。结果①CIP2A、β-catenin和C-myc在CML-AP/BP组的表达显著高于CML-CP组和对照组(P<0.05), CML-CP组和对照组差异无统计学意义(P>0.05),CIP2A、β-catenin和C-myc在CML的表达均成正相关关系(P<0.05)。②CIP2A在未缓解组的表达显著高于缓解组(P<0.05)。结论CIP2A高表达可能是CML发生急变的机制之一，这个过程可能是通过上调C-myc实现的，而且CIP2A高表达与化疗疗效密切相关。

蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子;β-连环蛋白;C-myc;慢性粒细胞白血病;免疫组化

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,临床上分慢性期(chronic phase,CP)、加速期(accelerated phase,AP)和急变期(blastic phase,BP),一旦发生急变,患者往往在数月之内死亡,预后极差。Ph染色体的出现和BCR/ABL融合基因的形成是CML发生的重要机制。但是关于CML急变的机制目前仍不完全明确,探讨CML急变的机制对于改善疗效以及干预CML急变具有重要意义。蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子是最近被识别的一种癌蛋白[1],在多种实体瘤中高表达并与恶性肿瘤的发生及转移浸润有关,然而关于CIP2A在CML中的研究很少。本研究采用免疫组化方法同时检测CIP2A、β-catenin和C-myc在CML各期中的表达,初步探讨CIP2A在CML发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1研究对象 参照张之南主编的《血液学诊断标准》[2],46例CML患者为我院2008年7月至2012年6月门诊及住院患者：男27例,女19例,平均年龄44.7(18-75)岁。慢性期31例(CML-CP组),加速期2例和急变期13例(CML-AP/BP组), CML-AP/BP组15例化疗后完全缓解11例(缓解组), 未缓解4例(未缓解组)。对照组为21例骨髓表现大致正常的非恶性血液病患者,其中男13例,女8例,平均年龄42.2(19-71)岁。

1.2检测方法及试剂 免疫细胞化学SP法检测骨髓单个核细胞(BMMNC)中CIP2A、β-catenin和C-myc。CIP2A多克隆抗体为Santa Crus公司产品，β-catenin及C-myc单克隆抗体、S-P免疫标记试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。髂后或髂前上嵴穿刺取骨髓,用淋巴细胞分离液(比重1.077)分离BMMNC并涂片,干燥后用新鲜配制的丙酮溶液于室温下固定30 min,用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH7.4)漂洗3次;0.1%Triton100通透10 min,再用PBS漂洗3次,然后根据试剂说明书进行操作。每一批实验均设阳性及阴性对照，阳性对照采用胃癌切片(由试剂公司提供),阴性对照以PBS代替一抗。

1.3结果判定 细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒染色为阳性。综合考虑显色程度及阳性颗粒所占的面积:40倍显微镜下每张载玻片计数5个视野,每个视野计数100个细胞,取阳性细胞百分率的平均值作为该份标本的阳性细胞百分率计分,分值按<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别计为0，1，2，3，4分;每个细胞按染色强度分不着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色4个级别分别计为0,1,2,3分，算出总分除以500作为该份标本的平均显色程度;最后将两者分数相加,<2分为阴性(-),≥2分为(+)。

1.4临床治疗方案 慢性期给予羟基脲控制白细胞,加速期和急变期联合应DA、HA(高三尖杉酯碱、阿糖胞苷)等方案化疗,疗效标准参照张之南主编的《血液学诊断标准》[2]。

1.5统计学方法 所收集数据采用EXCEL2003建立数据表,导入SPSS 13.0统计软件进行统计学处理,计数资料比较采用检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1cIP2A、β-catenin和C-myc在CML各期BMMNC的表达 CIP2A阳性产物呈棕黄色颗粒状定位于细胞浆,C-myc阳性表达为棕黄色颗粒位于细胞核与细胞浆,CML-AP/BP组BMMNC中CIP2A和C-myc蛋白阳性表达显著高于对照组(P<0.05),CML-CP组和对照组无显著性差异(P>0.05);β-catenin在CML-AP/BP组中呈强阳性表达于胞浆和胞核,在CML-CP组和对照组呈弱阳性表达于胞浆,β-catenin在CML-AP/BP组的表达显著高于CML-CP组和对照组(P<0.05)。未缓解组CIP2A的表达显著高于缓解组(P<0.05)。见表1。

表1 CIP2A、β-catenin和C-myc阳性表达的相关性

2.2CIP2A、β-catenin和C-myc在CML中表达的相关情况 经Pearson相关分析显示，CIP2A、β-catenin和C-myc阳性表达率呈正相关。见表2。

表2 CIP2A、β-catenin和C-myc阳性表达的相关性

3 讨论

bcr-abl基因的产生是慢性粒细胞白血病的重要发生机制,基于此机制的靶向治疗药物酪氨酸激酶抑制剂的应用使CML治疗大为改观,但是远期疗效仍不容乐观,一旦发生急性变,患者往往在数月之内死亡,因此探讨CML急性变的机制,可为寻求新的治疗方法提供理论基础。

CIP2A(cancerous inhibitor of PP2A)是近年来识别的能够抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性的蛋白,基因定位于人第3号染色体3q13,DNA长度约为38.8 kb,mRNA长为4284 bp,含有21个外显子,蛋白质相对分子质量为90 kDa[3]目前发现在人头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)、结肠癌、胃癌和乳腺癌组织中高表达,但在正常组织不表达或低表达[4,5],提示CIP2A可能是一种普遍存在的致癌因子。王涓冬等[6]在超过70%的初治/复发的急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞中检测到CIP2A的表达，健康志愿者和化疗后完全缓解AML患者骨髓单个核细胞中弱表达,而且在人类白血病细胞系HL60、THP-l、Jurkat T和K562中CIP2A也呈现高表达,提示CIP2A是一种急性白血病相关的癌基因,参与了AML的发病过程。但是CIP2A在CML患者中的表达及意义,尚不明确,我们通过免疫组织化学法检测CML患者骨髓单个核细胞中CIP2A,发现CIP2A在CML-AP/BP中高表达,显著高于CML-CP组和非恶性血液病组(P<0.05),CML-CP组和非恶性血液病组无显著差别(P>0.05),提示CIP2A可能在CML急性变中发挥了重要作用。β-连环蛋白(β-catenin)是一种多功能蛋白质,一方面参与细胞间的黏附[7],另一方面作为Wnt信号转导途径关键的信号分子,参与多种信号转导,在细胞增生、组织修复、胚胎发育及癌症的发生过程中发挥重要作用[8]。李增军[9]等进一步从mRNA水平证实β-catenin在CML急变期转录水平上调，而且与表达升高的bcr-abl成正相关。C-myc是Wnt信号转导通路下游的一个靶癌基,Giles[10]等证实C-myc在多种肿瘤中过表达,在肿瘤发生过程中起重要作用,β-catenin可通过Tel-4连接C-myc启动子位点来激活其表达,Sawyers CL发现C-myc在慢粒中存在高表达[11],Weissman等[12]进一步证实Wnt/β-catenin信号转导通路在慢性粒细胞自血病(CML)急变和加速期以及对Imatinib耐药的CML患者中激活。其异常激活后,导致CML祖细胞的持续扩增,在CML由慢性期进入加速及急变期的过程中起重要作用。本研究显示β-catenin和C-myc在CML-AP/BP组高表达而且成正相关(P<0.05),进一步证实Wnt途径在CML急变期被激活。Junttila[13]等发现CIP2A能够抑制PP2A对癌蛋白C-myc第62位丝氨酸(S62)的脱磷酸化作用,抑制C-myc蛋白水解,使C-myc水平升高,从而促进细胞的恶性转化及肿瘤的进展;Perrotti D[14]等发现CML急变期的患者中PP2A的活性显著受抑,本研究发现CML急变期高表达的CIP2A和C-myc成正相关(P<0.05)，这提示二者在CML急变中起协同作用，高表达的CIP2A可能通过抑制PP2A的活性,使C-myc去磷酸化受阻,进而抑制C-myc降解而升高,导致CML的急变,CIP2A可能通过Wnt途径参与CML的急变。

在一些实体肿瘤中,CIP2A蛋白的高表达与预后不良相关[4,5]。Khanna等[15]报道CIP2A在胃癌组织的过度表达与胃癌总体生存率降低相关,提示CIP2A可能是一个的独立预后因素。CML急变患者预后差,生存期短,本研究发现β-catenin和C-myc在未缓解组的表达虽然高于缓解组，但无统计学差异，这可能和病例较少有关。而CIP2A在未缓解组的表达则显著高于缓解组(P<0.05),这提示CIP2A的高表达不但参与了CML的急变,而且使得CML急变细胞对化疗药物的敏感性下降,因此CIP2A高表达可能提示CML预后不良,针对CIP2A的靶向治疗可能为CML的治疗提供新的途径。

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473000 南阳医学高等专科学校第一附属医院血液科