红腺忍冬花中绿原酸提取工艺研究

舒孝顺，卿婉华，许凯扬，蒋方兵，刘瑞兴

长沙理工大学化学与生物工程学院，长沙 410004

红腺忍冬［1，2］(Lonicera japonica)为忍冬科植物，是我国常用中药，具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆的功能。常以干燥花蕾或初花入药。列在2005年版中国药典“山银花”项下，红腺忍冬资源丰富，主产于河南、山东、云南及广西等地，是山银花药材商品的主要来源之一。长期以来，红腺忍冬山银花花蕾和初花一方面大量入药，另一方面还作为提取酚酸类化合物的工业原料。化学和药理研究证实［3，4］其主要化学成分有挥发油类、酚酸类、黄酮类和苷类，药理作用主要有抗菌、抗病毒、解热和抗氧化，酚酸类化合物(CHA)是红腺忍冬山银花花蕾和初花的主要有效成分，包括绿原酸、异绿原酸和咖啡酸等成份，但品种与产地不同而不同，因此山银花中绿原酸含量的高低，是其质量优劣的重要标志。

目前，提取金银花及山银花等植物中绿原酸的报道较多［5-8］，但有关红腺忍冬花中绿原酸的研究报道几乎没有，更无有关提取方法及工艺优选报道，本研究采用溶剂浸提法中的回流醇提法，相比其他方法更适合于中试及工业生产，采用正交试验优选红腺忍冬花绿原酸的最佳提取工艺，旨在为红腺忍冬花及酚总酸类物质的医药及保健食品开发利用提供参考，为红腺忍冬花绿原酸的进一步开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

乙醇回流提取装置，高速万能粉碎机:FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司;紫外可见分光光度计:UV754型，上海精密科学仪器有限公司;电子天平:AY220型，SHIMADZU CORPORATION JAPAN。实验用水:蒸馏水;对照品绿原酸(批号110754)为中国药品生物制品检定所提供。95%工业乙醇、盐酸、氢氧化钠、乙醇等试剂均为国产分析纯。

1.2 实验材料

红腺忍冬山银花于2012年采自湖南(野生)，经舒孝顺教授鉴定为红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.，药材于 60℃烘干，粉碎，过 60目筛，再于60℃烘至恒重，置干燥器中作供试品备用。

1.3 对照品溶液的配制

精密称取绿原酸对照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加70%乙醇适量，使其完全溶解并稀释至刻度。摇匀，然后用移液管吸取7.5 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，加70%乙醇至刻度线，制成15 mg/L的标准溶液，置于冰箱中避光保存。

1.4 标准曲线的制定［7］

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液适量，置10 mL量瓶中，再加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，在分光光度计上于200～400 nm扫描。对照品溶液与供试品溶液在329 nm处均有最大吸收。故将329 nm作为测定波长。精密量取对照品溶液1、2、3、5、7、9、10 mL 于10 mL 容量瓶，用70%乙醇定容，摇匀。以70%乙醇作参比液，在329 nm处测定其吸光度，以标准品质量浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5 绿原酸的提取与测定

称取5.000 g红腺忍冬山银花，一定量的溶剂于圆底烧瓶中，以料液比1∶6～1∶14，50% ～90%乙醇为提取液在80℃下进行回流提取，抽滤，滤液置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，摇匀。取此样品液0.5 mL置于10 mL比色管中，然后按1.4方法测定溶液的吸光度，通过标准曲线计算出样品绿原酸的平均含量，再计算相应提取率。

1.6 单因素实验与正交实验

对影响乙醇回流提取的5个因素(溶剂乙醇浓度、溶剂体积、溶剂pH、提取时间、提取次数)，设计5个水平进行实验，药材用量5 g，所有实验都在80℃下进行，通过比较提取率确定对提取率影响较大的4个因素再进行正交实验。正交实验因素水平表见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experimental design

2 结果与分析

2.1 标准曲线及回归方程

以绿原酸样品的浓度为横坐标，以在329 nm下测得不同浓度的标准品的吸光值为纵坐标，做标准曲线，得到回归方程为:Y=0.0608X-0.0056，R=0.9998。结果表明，绿原酸在1.50～15 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度

准确称取5份(5.0000 g)红腺忍冬山银花粉末，分别取体积分数为50%、60%、70%、80%、90%乙醇各100 mL，调pH至3，在80℃水浴锅中回流提取2 h，提取2次，趁热过滤，合并两次滤液，冷却后，按照1.5的方法计算绿原酸含量，并计算相应提取率。得到乙醇浓度和绿原酸提取率之间的关系图(见图1)。由图可以看出，当乙醇浓度低于70%时，绿原酸的提取率随着乙醇浓度的升高而显著增大，乙醇浓度为70%时达到最大，之后随着乙醇浓度的进一步增大提取率反而减小，可能在较高浓度乙醇中，绿原酸溶解度逐步减小。因此选择70%乙醇为提取溶剂。

图1 溶剂浓度对提取率的影响Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction rate

2.2.2 料液比对提取率的影响

准确称取5份(5.0000 g)红腺忍冬山银花粉末，分别取料液比为 6、8、10、12、14 倍体积的 70%乙醇，调pH至3，在80℃水浴锅中回流提取2 h，提取2次，趁热过滤，合并两次滤液，冷却后，按照1.5的方法计算绿原酸含量，并计算相应提取率。得到料液比和绿原酸提取率之间的关系图(见图2)。由图可以看出当溶剂体积倍数达到10倍后，随着溶液体积的增大，提取率增加量少且缓慢，从经济方面考虑，选择料液比1∶10。

图2 溶剂体积对提取率的影响Fig.2 Effect of material-solvent ratio on extraction rate

2.2.3 溶剂pH对提取率的影响

准确称取5份(5.0000 g)红腺忍冬山银花粉末，分别取pH 值调为2、3、4、5、6的70%乙醇各100 mL，在80℃水浴锅中回流提取2 h，提取2次，趁热过滤，合并两次滤液，冷却后，按照1.5的方法计算绿原酸含量，并计算相应提取率。得到溶剂pH和绿原酸提取率之间的关系图(见图3)。由图可以看出，随着溶剂pH升高，绿原酸的提取率上升，在pH4时达到最高点，pH继续升高提取率开始下降，这可能是由于部分绿原酸在较高pH环境下发生降解，故选择pH4。

图3 溶剂pH对提取率的影响Fig.3 Effect of solvent pH on extraction rate

2.2.4 提取时间对提取率的影响

准确称取5份(5.0000 g)红腺忍冬山银花粉末，分别取pH值为4的70%乙醇100 mL 5份，在80 ℃水浴锅中分别回流提取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，提取2次，趁热过滤，合并两次滤液，冷却后，按照1.5的方法计算绿原酸含量，并计算相应提取率。得到提起时间和绿原酸提取率之间的关系图(见图4)。由图可以看出，在1～2 h内，绿原酸提取率随时间增加不断增长，在2.0 h达到最大值，此时绿原酸基本上已完全提取，由于绿原酸对温度敏感，长时间在较高温度不稳定易降解，同时从生产周期方面考虑，实验选择提取时间为2 h。

图4 提取时间对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction duration on extraction rate

2.2.5 提取次数对提取率的影响

准确称取5份(5.0000 g)红腺忍冬山银花粉末，取pH值为4的70%乙醇100 mL 5份，在80℃水浴锅回流提取2次，每次分别提取1、2、3、4、5次，趁热过滤，合并两次滤液，冷却后，按照1.5的方法计算绿原酸含量，并计算相应提取率。得到提起次数和绿原酸提取率之间的关系图(见图5)。由图可以比较得出，当提取次数为2次时，提取率基本上达到最大，继续增加提取次数，绿原酸的提取率基本维持不变，为简化提取工艺，缩短生产周期，选择绿原酸的最佳提取次数为2次。

图5 提取次数对提取率的影响Fig.5 Effect of times of extraction on extraction rate

2.3 正交实验

2.3.1 正交实验结果与分析

根据绿原酸的理化性质、生产实际及单因素实验结果，选取乙醇浓度(A)、料液比(B)、回流时间(C)及提取次数(D)4个因素进行正交实验，以红腺忍冬山银花乙醇提取物中绿原酸含量及提取率为主要评价指标优化提取条件。正交实验结果见表2。

表2 绿原酸提取正交实验表Table 2 L9(34)orthogonal experimental result

由表2直观分析可得:四个因素对绿原酸提取率影响的显著性依次为D＞A＞B＞C，即对绿原酸提取率的主次影响为:提取次数＞乙醇浓度＞料液比＞提取时间，最佳提取工艺条件为A2B3C1D2，即乙醇浓70%，回流时间为2 h，料液比1∶10，其提取率为4.85%。

2.3.2 验证实验

精密称取5.0000 g红腺忍冬山银花粉末，按最佳提取方案A2B3C1D2进行验证实验，实验重复三次，结果取平均值，结果得到绿原酸平均提取率为4.81%。

3 结论

通过正交实验L9(34)验证，确定了红腺忍冬山银花中绿原酸最佳提取工艺条件为:乙醇浓度70%，回流时间为2.0 h，料液比1∶10，提取2次，回流温度80℃，在最佳的提取工艺条件下测得红腺忍冬山银花中绿原酸提取率为4.85%，本研究对推动我国红腺忍冬花绿原酸的产业化发展有着积极的意义。

本实验通过分光光度法测定红腺忍冬山银花中绿原酸含量及提取率，选择最佳提取工艺条件，为红腺忍冬花绿原酸在药品及保健食品方面的进一步开发利用提供了依据，此方法准确度较高，操作简便，安全可靠。

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