复方白花蛇舌草和半枝莲总黄酮提取工艺的研究

胡 荣，李召辉，杨荣平，秦伟瀚，张小梅，王云红，励 娜，罗先钦*

1重庆市中药研究院，重庆 400065;2重庆市第五人民医院，重庆 400062

白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草［Oldenlandia diffusa(Willd.)Roxb.］的全草［1］，临床上广泛用于各种肿瘤的治疗，尤多用于治疗食道癌、胃癌、肝癌、直肠癌等消化系统肿瘤以及子宫颈癌、淋巴癌、鼻咽癌等［2］。半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲(Scutellaria barbata D.Don)的全草，临床多用于治疗肝癌、肺癌、胃癌、直肠癌和鼻咽癌［3］。现代生物医学研究，黄酮类化合物对体内、体外均有明显的肿瘤抑制作用，并能清除自由基［4］。半枝莲和白花蛇舌草配伍，将有似中药七情配伍中的相须之用，可增强抑癌、排毒作用［5］。本研究以半枝莲/白花蛇舌草质量比为1∶1为原料，对其总黄酮等活性成分提取条件进行研究，为进行创新药物的研究和开发奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 实验材料

白花蛇舌草，购自重庆中药材饮片厂有限公司，经重庆市中药研究院钟国跃教授鉴定为茜草科植物白花蛇舌草(Oldnlandia diffusa Willd.)的干燥全草，产地江西，批号100401;半枝莲，购自太极集团四川绵阳制药有限公司，经重庆市中药研究院钟国跃教授鉴定为唇形科黄芩属植物半枝莲(Scutellaria barbata D.Don)的全草，产地湖北，批号55100005;芦丁对照品，中国药品生物制品检定所，批号:100080-200306;其余试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

UV-1601型紫外可见分光光度计(日本岛津);AEG-45SM电子天平(日本岛津公司);98-1-B型电子调温电热套(天津泰斯特仪器有限公司);DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)。

2 方法和结果

2.1 白花蛇舌草和半枝莲总黄酮的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

取芦丁对照品4.5 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，即得浓度为180 μg/mL的标准品溶液。

2.1.2 最大吸收波长

取对照品溶液，稀释至一定浓度，以甲醇为空白，于紫外分光光度仪上，在400～900 nm范围内扫描。结果表明对照品溶液在510±1 nm处有最大吸收，所以选定510 nm作为总黄酮测定波长。

2.1.3 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液 1、2、3、4、5 与 6 mL，分别置25 mL的量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亚硝酸溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，照紫外分光光度法，在510 nm波长处测定吸光度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。计算得回归方程Y=0.0115X，r=0.9998。试验结果表明芦丁在7.2～43.2 μg/mL范围内呈现良好的线性关系。

2.1.4 样品含量测定

白花蛇舌草和半枝莲总黄酮提取液精密量取1 mL置于25 mL量瓶中，按2.3项下自“各加水至6.0 mL”起，依法测定吸光度值，计算总黄酮提取液中多糖含量。

总黄酮含量(%)=样品溶液中总黄酮含量×样品溶液稀释倍数/生药重量

2.2 总黄酮提取工艺

2.2.1 总黄酮提取方法

取白花蛇舌草和半枝莲质量比为1∶1的原料若干，用乙醇提取若干小时，合并多次提取所得的滤液，即得总黄酮提取液。

2.2.2 总黄酮提取正交试验

取原料9份，称重，每份10 g，采用正交试验法考察影响白花蛇舌草和半枝莲总黄酮提取效率的因素，选择乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)作为影响因素，每个因素选择3个水平，如表1所示，以总黄酮含量作为考察指标，进行L9(34)正交试验优选，结果如表2。

表1 L9(34)正交试验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

表2 L9(34)正交试验安排结果Table 2 Results of orthogonal tests

9 3 3 2 1 16.5 K1 20.800 18.767 18.867 15.700 K2 21.267 21.133 21.433 21.267 K3 19.267 21.433 21.033 24.367 R 2.000 2.666 2.566 8.667

试验结果表明，影响白花蛇舌草和半枝莲总黄酮提取的各因素中，D＞B＞C＞A，其中因素D和B因素对多糖的提取影响较大，最佳提取工艺为A2B3C2D3，即用药材30倍量的70%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，并进一步进行验证。

2.2.3 正交试验验证

称取白花蛇舌草和半枝莲药材共10 g，共3份，根据筛选确定的最优提取方案A2B3C2D3，进行正交实验验证，试验结果见表3。

表3 验证实验结果Table 3 Results of verification tests

试验结果表明，白花蛇舌草和半枝莲多糖的含量稳定在27 mg/g左右，提示本正交试验优选的工艺条件理想、可靠。

3 讨论

本研究参考《中国药典》2010版一部中测定槐花［6］总黄酮的方法，采用紫外分光光度法以芦丁为对照品，测定白花蛇舌草和半枝莲醇提取物中总黄酮的含量，经试验表明该方法是一种简便可行的测定该复方总黄酮的方法。

乙醇是一种极性适中、渗透性强和毒性小的有机溶剂。黄酮类化合物又属于中级性化合物。因此本研究选用乙醇作为提取溶剂，采用正交试验设计法优选白花蛇舌草和半枝莲总黄酮的最佳提取工艺。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中华人民共和国药典).Beijing:China Medical Science Press，2010.appendix 23.

2 Zhong LM(钟立敏)，Zhong HX(周宏霞)，Liu D(刘丹).Pharmacology and clinical application progress of Hedyotis diffusa.Info Tradit Chin Med(中医药信息)，2001，18(4):14-16.

3 Xu FM(许风鸣)，Wang ZQ(王兆全)，Li YW(李有文).Studies on the chemical constituents of Scutellaria barbat II.Chin J Mod Applied Pharm(中国现代应用药学)，1997，14(6):8.

4 Li S(李省)，Yang BH(杨保华)，Chen Y(陈悦)，et al.The content analysis of total flavonoids in Scutellaria barbat.Chin J Public Health(中国公共卫生)，2005，21:847-848.

5 Hu R(胡荣)，Luo XQ(罗先钦)，Yang RP(杨荣平).Study on the preparation technology of polysaccharides in Oldenlandia diffusa Willd.and Scutellaria barbata D.Don.Chongqing Yixue(重庆医学)，2011，40:45-47.

6 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中华人民共和国药典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，333-334.