西藏红景天提取物延长线虫寿命和抗氧化活性探索

肖家军，陆 媚，马胜利，李 锦

淮南师范学院生命科学系，淮南 232001

红景天为景天科红景天属，多年生草本或亚灌木植物，是珍稀药食两用植物之一，有“高原人参”之誉。该属全世界有九十多种，我国约七十三种，居世界之首，主要分布在东北、西藏、新疆等地。我国在红景天的应用方面有悠久的历史:公元1200年的藏医《四部医典》已有记载，秦汉时期的《神农本草》、李时珍的《本草纲目》等都有记载，而且卫生部1991年批准红景天为新食品资源。近十多年的研究证明，红景天具有提高机体免疫力、增强体质、抗氧化、抗疲劳、以及预防高原反应等多种功能［1］。

红景天中含有多种化学成分，其中红景天苷为迄今研究最多的已知有效成分之一，已经成为众多临床药物的主要成分之一［2］。近年来研究也发现，红景天苷具有抗辐射、抗缺氧等多种作用。为进一步发掘红景天的有效成分，我们比较了红景天粗提物及红景天苷对延长秀丽隐杆线虫寿命的差异，并从体外抗氧化活性的角度对其可能的机制作了初步分析。

1 材料与仪器

红景天苷(重庆寰瑞生物技术有限公司，纯度＞95%)、红景天(青海雪域源土特产开发有限公司)、邻苯三酚(温州瓯海精细化工有限公司)、30%过氧化氢(宿州化学试剂厂)、维生素C(上海融禾医药科技有限公司，纯度＞98%)，其它试剂均为分析纯。

E．coli OP50、野生型秀丽隐杆线虫(N2)由本系王顺昌教授惠赠。

RE3000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器公司);UV2300型紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);DNP-9022电热恒温培养箱(上海光都仪器设备有限公司);SW-CJ-1D型单人净化工作台(苏州净化设备有限公司);WD800CTL23-2H型格兰仕微波炉(广东佛山格兰仕微波炉有限公司);FZ102型微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 红景天成分的提取及浓度的配制

原料红景天35度鼓风干燥，磨碎，过100目筛，称取适量红景天粉，水煮3次，合并水煮液，过滤，浓缩，得到母液为1 g/mL。用三蒸水配制不同浓度的红景天粗提物溶液、红景天苷溶液和VC溶液。

NGM(Nematodegrowth medium)标准培养基(1L)［3］121 ℃灭菌30 min，灭菌后加入1M CaCl2及1M MgSO4各l mL和25 mL 1M pH 6.0磷酸钾缓冲液。E．coli OP50接种于含有不同药物浓度的LB固体培养基中，37℃过夜后，置于4℃备用。雌雄同体线虫N2，接种于涂布E．coli OP50，且细菌生长良好的NGM上，恒温20℃培养。

2.2 红景天粗提物、红景天苷等延长线虫寿命实验

秀丽隐杆线虫寿命实验设对照组和含药组，对照组不含药物，用药组从低到高设3个浓度梯度。各组培养基中均含12.5 mg/L5-Fu以抑制线虫子代的孵育，据文献报道［4］，12.5 mg/L 5-Fu不影响线虫寿命。挑取同步化的L4期线虫到各组培养基中，每种药物含30条，每个浓度板中含有10条，于20℃培养。从转移时刻起开始计算线虫存活天数，转移当天记为寿命实验第0天(day0)。隔天检查线虫，记录死亡线虫数，剔除逃逸、意外死亡和囊样线虫。线虫死亡判断标准:用铂丝轻触虫体，无任何反应，即可判断为死亡。

2.3 红景天的体外抗氧化实验

2.3.1 红景天粗提物溶液、红景天苷溶液清除DPPH 自由基［5］

取生药量为1 g/mL的红景天粗提物溶液进行浓度梯度稀释，分别取出2 mL离心管中，并加入2 mL 0.25 mmol/L的 DPPH溶液，分别标记为 A1、A2、A3、A4、A5。暗处静置 30 min，在 517 nm 处测光吸收值Ai。

再分别从浓度梯度母液取出2 mL于离心管中，并加入2 mL的50%乙醇，分别标记为A1’、A2’、A3’、A4’、A5’。暗处静置 30 min，在 517nm 处测光吸收值Aj。

以2 mL 0.25 mmol/L的DPPH和2 mL 50%乙醇反应作参照，暗处静置30 min，在517 nm处测吸收值 A0。

由公式:清除率 P%=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%，计算清除DPPH能力。红景天苷溶液和Vc溶液实验过程相同。

2.3.2 红景天粗提物溶液、红景天苷溶液清除羟基自由基［6］

取生药量为1 g/mL的红景天粗提物溶液进行梯度稀释，取有刻度的试管，分别标记为 B1、B2、B3、B4、B5。向5 mL离心管中加入0.5 mL的 Fe-SO4溶液，0.5 mL的H2O2溶液，1 mL的水杨酸溶液，1 mL的样品液，1 mL的三蒸水，然后置于37℃的恒温水浴锅中反应30 min，取出在3000 r/min离心10 min，最后在510 nm波长处测吸光度值Ai。

用三蒸水代替水杨酸，方法和上面相同，在波长510nm处测吸光值为Aj。

空白对照组以三蒸水代替母液，其他和上面相同，在波长510nm处测吸光值为A0。由公式:清除率P%=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%，计算清除羟基自由基能力。红景天苷溶液和Vc溶液实验过程相同。

2.3.3 红景天粗提物溶液、红景天苷溶液和Vc溶液清除超氧自由基［7］

向10 mL离心管中加入1 mL的三蒸水，4 mL的缓冲液，然后置于25℃的恒温水浴锅中反应200 min，加入0.1 mL的邻苯三酚，混匀，再继续水浴5 min，最后加入1 mL 8 mol/L的盐酸，在420 nm波长处测其吸光度值。

取生药量为1 g/mL的红景天粗提物溶液进行梯度稀释，取有刻度的试管，分别标上C1、C2、C3、C4、C5，向离心管中加入1 mL的样品液，4 mL的缓冲液，然后置于25℃的恒温水浴锅中反应20 min，加入0.1 mL的三蒸水，混匀，再继续水浴5 min，最后加入1 mL 8mol/L的盐酸，在420 nm波长处测其吸光度值。由公式:清除率P%=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%，计算清除超氧自由基能力。红景天苷溶液和Vc溶液实验过程相同。全部抗氧化实验重复3次，计算平均值。

3 实验结果与分析

3.1 红景天粗提物等对秀丽隐杆线虫寿命的影响

图1 红景天苷、红景天粗提物等药物对线虫寿命的影响Fig.1 Effects of extending life span of C．elegans with the extract of Rhodiola tibetica and salidroside

从图中可以看出，无论是与红景天苷相比，还是与黄芪粗提物相比，红景天粗提物在延长秀丽隐杆线虫寿命方面都显示了明显的优势。在相同条件下，红景天粗提物相比红景天苷能够显著延长线虫寿命，提示在红景天粗提物中可能存在能明显影响动物寿命的物质。

3.2 红景天苷的体外抗氧化活性测定

图2 红景天苷、红景天粗提物、Vc清除DPPH自由基Fig.2 Scavenging activities of the extracta of R．tibetica，salidroside and Vc on DPPH free radical

3.2.1 各物质对DPPH自由基的清除作用

图3 红景天苷、红景天粗提物、VC清除羟基自由基Fig.3 Scavenging activities of the extracta of R．tibetica，salidroside and Vc on hydroxy radical

由图可以看出，样品液随着浓度的不断增大，清除DPPH自由基的能力也逐渐增强。借助DPS数据处理软件对数据进行处理，得出红景天苷溶液的EC50(即清除率达到50%时所需药物的浓度为1291.53 μg/mL，而红景天粗提取物溶液的EC50为489.76 μg/mL，VC的 EC50为 8.75 μg/mL。经计算得出红景天苷溶液的EC50约是红景天提取物溶液的2.6倍，约是VC的147.6倍。

3.2.2 各物质对羟基自由基的清除作用

由图可以看出，样品液随着浓度的不断增大，清除羟基自由基的能力也逐渐增强。借助DPS数据处理软件对数据进行处理，得出红景天苷溶液的EC50所需药物的浓度为1120.94 μg/mL，而红景天粗提取物溶液的EC50为1068.37 μg/mL，VC的EC50为579.27 μg/mL。经计算得出红景天苷溶液的EC50约是红景天提取物的1.1倍，约是VC的1.94倍。

4 红景天苷、红景天粗提物、VC清除超氧阴离子自由基Fig.4 Scavenging activities of the extracta of R．tibetica，salidroside and Vc on superoxide radical

3.2.3 各物质对超氧阴离子自由基的清除作用

由图可以看出，样品液随着浓度的不断增大，清除超氧阴离子自由基的能力也逐渐增强。借助DPS数据处理软件对数据进行处理，得出红景天苷溶液的EC50(即清除率达到50%时所需药物)的浓度为55.57 μg/mL，而红景天提取物溶液的EC50为40.49 μg/mL，VC的 EC50为 22.37 μg/mL。经计算得出红景天苷溶液的EC50约是红景天提取物溶液的1.4倍，约是VC的2.5倍。

4 讨论

人类对于衰老的研究，已经达到分子水平，众多的研究［8-10］表明，目前尚未发现目标单一的作用于衰老的基因，在研究的所谓衰老相关基因多是消除自由基的某些酶类基因，及与细胞生长调控有关的某些因子的基因。自由基对人体的危害是从对细胞和组织的损伤开始，Denham Harman博士 1956年［11］提出自由基衰老学说，其主要依据是在正常情况下机体的自由基的产生与消失处于动态平衡。一旦失去平衡即逐渐趋于老化，最终导致衰老，即生物体的衰老过程是机体的组织细胞不断产生的自由基积累结果。

红景天抗氧化活性受到很多学者的关注，国内学者大多以小鼠为研究对象，分析相关指标，探讨红景天的生物活性。从本实验结果中可以看出，对秀丽隐杆线虫寿命的影响中，红景天的主要有效成分红景天苷影响较小，而红景天的粗提物表现较大优势。体外抗氧化结果表明，与VC相比，红景天苷具有一定的清除DPPH、羟基自由基、超氧阴离子自由基能力，但抗氧化活性并不高，另一方面，红景天苷与红景天粗提物在清除这三种自由基的能力比较中，实验数据表明，在相同实验条件下，红景天粗提物清除三种自由基的能力均强于红景天苷，说明在红景天中应该还存在某种或某类物质，其抗氧化活性比红景天苷要强很多，具体成分还有待进一步研究。

1 He XH(贺晓华)，Xu L(许龙)，Tan MJ(谈满江)，et al.DPPH radical scavenging effect of Penthorum chinense Pursh extract.Lishizhen Med Mater Med Res(时珍国医国药)，2009(2):221-224.

2 Jin P(金萍).Research situation of the Rhodiola.Guangming J Chin Med(光明中医)，2011，26:1508-1511.

3 Brenner S.The genetics of Caenorhabditis elegans.Genetics，1974，77:71-94.

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5 Wu QY(吴琼英)，Jia JQ(贾俊强).Study on ultrasonic-assisted extraction and antioxidation of Pomelo peel flavonoids.Food Sci(食品科学)，2009(2):29-33.

6 Liu HL(刘辉琳)，Tang ML(唐明林)，An LY(安莲英)，et al.New technology for extracting chemical composition from Chinese herbal medicine.Guangzhou Chem(广州化学)，2002，12(2):59-64.

7 Wang T(王婷)，Zhang JC(张金超)，Chen Y(陈瑶)，et al.Comparison of antioxidative and antitumor activities of six flavonoids from Epimedium koreanum.Chin Pharm J(中国药学杂志)，2007:715-717.

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9 Murphy CT，McCarroll SA，Bargmann CI，et al.Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.Nature，2003，424:277-284.

10 Wang MC，Bohmann D，Jasper H.JNK extends life span and limits growth by antagonizing cellular and organism-wide responses to insulin signaling.Cell，2005，121:115-125.

11 Harman D.Aging:a theory based on free radical and radiation chemistry.J Gerontol，1956，11:298-300.