正交设计和动态过程优化两面针超声提取工艺

陆世惠，邓凤云，卢红梅

1右江民族医学院药学院;2广西百色市中医医院，百色 533000

两面针，Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.，又名钉板刺、入山虎、入地金牛等，系芸香科花椒属植物，主要分布于广西、广东、云南、贵州等地，主治风湿骨痛、跌打损伤、胃痛、牙痛、毒蛇咬伤等症，现代医学证明其有抗癌作用，其主要含生物碱，且主要为苯并菲啶类生物碱［1］。因此，提取两面针总生物碱具有重要意义。作者［2］证实用纤维素酶、果胶酶预处理两面针后再提取，可促进总生物碱提取率的提高。莫肖云等［3］初步探索了超声法提取两面针总生物碱，不过提取率较低，需要进行工艺优选。目前正交设计优选工艺的提取时间多是间隔一定时间进行考察，各次提取都用相同时间。而实际上提取过程是动态变化的，且各次提取达到稳态期的时间并不相同，动态过程优化工艺能减少提取时间，降低生产成本［4］。为此，本实验研究酶解预处理后超声提取两面针总生物碱的工艺，先用正交设计进行工艺优化，再动态过程进一步优化提取时间。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TU1800紫外可见光分光光度计(北京普析通用公司);FA2004N型电子分析天平(上海民析精密科学仪器公司);KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器公司);CU-600型电热恒温水槽(上海齐欣科学仪器公司)。

1.2 试药

氯化两面针碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号:848-9901);纤维素酶(10000 U/g，南宁东恒华道生物制品公司);果胶酶(10000 U/g，南宁东恒华道生物制品公司);其他试剂均为分析纯。两面针药材购自广西南宁市药材市场，经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为两面针Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.的根和茎。

2 方法与结果

2.1 总生物碱的测定方法［5］

2.1.1 标准曲线的制备

精密称取氯化两面针碱对照品10.4 mg，甲醇溶解定容至50 mL得储备液。精密吸取储备液50、100、200、300、400 和 500 μL，以体积分数 60% 乙醇-pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液定容至10 mL，以溶剂为参比(蒸馏水吸光度为0，可代替溶剂)，于328 nm处测定吸光度(A)，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，得回归方程 A=0.09568X-0.0083(r=0.9995)，线性范围1.04～10.40 mg/L。

2.1.2 样品测定方法

将溶液样品乙醇体积分数调节至60%，1000 rpm离心5 min，倾出上清液作为供试液，精密取供试液适量，以标准曲线制备法测定总生物碱含量，计算总生物碱提取率(总生物碱提取率=提取得的总生物碱质量/药材中总生物碱的质量×100%)。

2.1.3 精密度试验

取5.20 μg/L的对照品溶液反复测定吸光度6次，以吸光度计算，RSD为0.12%。

2.1.4 稳定性试验

取样品溶液适量，依法分别于 0、4、8、16、24、48 h测定吸光度，RSD为0.35%。

2.1.5 重复性试验

取样品溶液适量，平行5份，依法测定吸光度，RSD为0.23%。

2.1.6 加样回收率试验

取已知浓度的样品溶液适量，平行5份，加入对照品适量，依法测定吸光度，结果平均加样回收率为99.6%，RSD为0.93%。

2.2 正交试验优选超声条件

将两面针药材粉碎(粒径≤0.5 mm)，准确称取药粉100 g，加入4倍量 pH 5的醋酸-醋酸钠缓冲液，用纤维素酶和果胶酶(酶底物质量比均为1∶250)于室温(30℃)下预处理30 min，然后用体积分数60%乙醇(含盐酸5 g/L)［2］进行超声提取。经单因素预试验发现，超声功率越大提取率越高，提取次数影响较大，超声时间超过15 min提取率增加不明显，而溶剂量影响较小。因此，设计L9(34)正交试验，考察超声功率(A)、提取次数(B)及超声时间(C)对总生物碱提取率的影响，因素水平见表1(若酶解后滤过，弃去滤液将造成损失。为简化工艺流程，酶解后不经滤过直接加乙醇、盐酸到原缓冲液中配成第1次提取溶剂，至少配成10倍量才能达到乙醇体积分数为60%。后续提取的溶剂量一般少于第1次，且不少于3倍量。故第1、2、3次提取分别用10、4、3倍量溶剂)。为提高统计分析的可靠性，重复试验1次，测定结果取均值进行统计分析，结果见表2，方差分析见表3。

从直观分析可见，因素影响大小为B＞A＞C，提取次数影响最大，超声功率次之，超声时间影响最小;从方差分析可见，提取次数的影响具有显著性。因此，最佳组合为A3B3C2，即9号试验:用250 W超声功率提取3次，每次15 min。

表1 超声提取因素水平表Table 1 Factors and levels of ultrasonic extraction

表2 超声提取L9(34)正交试验结果Table 2 Results of L9(34)orthogonal test of ultrasonic extraction

表3 超声提取方差分析Table 3 Analysis of variance of ultrasonic extraction

2.3 动态过程优化超声提取时间

按正交试验优选出的工艺进行超声提取，提取时间延长至24 min，在提取过程中每隔3 min抽取提取液5 mL，每次补足相同体积的60%乙醇(含盐酸5 g/L)。依法测定各样品液中的总生物碱浓度，结果见表4。

表4 超声提取各时间点提取液中的总生物碱浓度(g/L)Table 4 Content of total alkaloids in extract at different time of ultrasonic extraction(g/L)

通过表4可见，第1次提取15 min后，总生物碱浓度变化不超过1%;第2次提取12 min后，总生物碱浓度变化不超过2%;第3次提取9 min后，总生物碱浓度变化不超过3%。因此确定第1次超声提取稳态期为15 min，第2次超声提取稳态期为12 min，第3次超声提取稳态期为9 min，这就是各次超声提取的最佳时间。

2.4 最佳工艺验证及提取方法对比

按动态过程优化的超声提取工艺平行进行3份实验，总生物碱平均提取率为87.80%，RSD为0.98%。另按正交设计优选出的超声提取工艺平行进行3份实验，总生物碱平均提取率为87.93%，RSD为0.84%。可见，经动态过程优化提取时间，在保持总生物碱提取率的条件下，能进一步节能省时20%。

3 结论与讨论

本研究综合运用正交设计和动态过程优选两面针超声提取工艺，这两种方法具有互补作用。正交设计是常规的工艺优选方法，能够用较少的实验次数优选出比较科学合理的工艺，但是该法有二个不足，第一是当设计时间间隔较宽时难以选出最佳时间点，第二是多次提取都用相同的时间，而实际上后续提取往往较快达到稳态期，以相同时间提取就浪费能源和时间，随意缩短提取时间又缺乏依据，这也是该法最大的缺陷。动态过程优化法在一次实验中连续多次取样检测，可以准确把握每次提取达到稳态的时间，弥补正交设计的不足。从提取物浓度变化的动态过程中可以看到，随着提取次数的增加，提取到达稳态的时间越来越短，用动态过程优化工艺能够进一步节约能源，提高工作效率。此外，本工艺先以复合酶预处理药材，减小了有效成分溶出的传质阻力，再以超声波的空化作用和机械振动促进提取的进行，共同提高了总生物碱提取率和工作效率。因此，本工艺具有高效、节能、省时的特点。

1 Liu YC(刘延成)，Cheng FJ(成风杰)，Meng YQ(蒙衍强)，et al.Research progresses on the chemical components，pharmacological activity，and antitumoral mechanism of Zanthoxylum nitidum.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2012，24:550-555.

2 Lu SH(陆世惠)，Deng FY(邓凤云)，Lu HM(卢红梅)，et al.Optimization of extraction technology for total alkaloids from Zanthoxylum nitidum by enzymatic hydrolysis assisted immersion method.Chin J Exp Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志)，2012，18(23):43-45.

3 Mo XY(莫肖云)，Huang LX(黄丽秀)，Tian FN(田芳年)，et al.Ultrasound extraction the tota1 alkaloids from the Zanthoxylum nitidum.Chin Wild Plant Res(中国野生植物资源)，2009，28(5):58-62.

4 Wang DZ(王东喆)，Zhang J(章军)，Zhang LY(张丽艳)，et al.Research on the dynamic process optimization method of extraction technology.Chin J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2012，37:1388-1391.

5 Lu SH(陆世惠)，Long SJ(龙盛京).Determination of total alkaloids from Zanthoxylum nitidum in extraction solution by UV.Northwest Pharm J(西北药学杂志)，2008，23:350-352.