正交试验法优选复方四参颗粒剂的提取工艺

陈文娟，胡道德

上海交通大学附属第一人民医院，上海市 200080

复方四参颗粒剂由太子参、丹参、南沙参、苦参等9味中药组成，具有益气养阴、清热活血、养心安神之效。临床上主要应用于病毒性心肌炎。中医学上认为病毒性心肌炎为虚实相兼之证，虚以气阴两虚为主，实以瘀热交阻常见。复方四参颗粒剂的临床疗效显著，对症状的改善尤为明显;同时，对病毒性心肌炎后心律失常的控制也有较好的疗效。病毒性心肌炎所致的各类心律失常是临床治疗的重点和难点。抗心律失常西药具有显著的电生理特性，但作用单一，并不完全符合病毒性心肌炎的病理生理特点，部分患者疗效欠佳，而且有严重的副作用，如抑制心脏正常生理功能、诱发更严重的心律失常等。复方四参颗粒剂治疗病毒性心肌炎在我院取得了很好的疗效［1］。

丹酚酸B是丹参中抗病毒性心肌炎的活性成分，也是复方四参颗粒剂中的主要成分。为了提高丹酚酸B的得率，我们用正交实验法对影响丹酚酸B的提取条件如提取次数、煎煮时间、加水量等进行研究，优选最佳提取工艺，为实际生产提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);AL104电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);R-205旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司);SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(上海豫康科技仪器设备有限公司);W2010数控恒温浴锅(上海申胜生物技术有限公司);DW调热电热器(上海平环燃烧设备工程技术有限公司)。

1.2 试剂

甲醇为色谱纯;磷酸为分析纯;水为超纯水;太子参、丹参、南沙参、苦参等药材购于上海万仕城国药制品有限公司;丹酚酸B对照品购于中国药品生物制品检验所，供含量测定用(批号111562-201110)。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计

选择药材加水量(A)、煎煮次数(B)、煎煮时间(C)作为考察因素。本实验采用L9(34)正交表安排实验。以丹酚酸B含量和干膏得率为指标对复方四参颗粒剂的提取工艺进行优选。因素水平表见表1。

2.2 样品提取液的制备

按正交表的实验安排，依处方比例称取各味药材，加水浸泡过夜，煎煮、合并提取液，离心取上清液，上清液浓缩成流浸膏，调整流浸膏的密度在1.15～1.2之间，得样品提取液。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal design

2.3 丹酚酸B含量测定方法的建立

2.3.1 色谱条件［2］

色谱柱:C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液;检测波长:286 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:25℃;理论板数:61367;进样体积:10 μL。

2.3.2 供试品溶液制备

取提取浓缩液0.1 mL，加75%甲醇0.9 mL，混匀，离心，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.3 对照品溶液的制备

精密称取丹酚酸B对照品0.4587 mg至25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.018 mg/L丹酚酸B对照品储备液。

2.3.4 阴性对照溶液制备

按处方比例称取除丹参外的其他药材，按照与供试品相同的方法制备阴性对照液。

2.3.5 标准曲线绘制

精密吸取对照品溶液 5、10、15、20、30 μL 进样，记录峰面积，以丹酚酸B面积对进样量线性回归。回归方程为 A=7139．6C-28．398(R2=1.0000)，结果表明，丹酚酸B在0.92～5.4 μg线性良好。

2.4 干膏得率的测定［3］

精密吸取提取液7 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3 h至恒重，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算干膏得率。

2.5 丹酚酸B含量测定

分别吸取供试品溶液和阴性对照品溶液按上述色谱条件进样，测定峰面积，代入标准曲线，计算丹酚酸B的含量。供试品及阴性对照溶液色谱图见图1。正交实验结果见表2。方差分析见表3、4。

2.6 最佳提取工艺的确定

表2中，直观分析和效应曲线图结果表明，以干膏得率为指标，方差分析结果见表3，各影响大小为C＞B＞A，即提取时间＞提取次数＞加水量，最佳提取工艺为A3B1C3，次优工艺为A2B2C3;以丹酚酸B含量为指标，方差分析结果见表4，各影响大小为B＞A＞C，最佳提取工艺为 A3B2C1，次优工艺为A2B2C3。由此得出最优工艺为A2B2C3。丹酚酸B对热不稳定，随着煎煮时间的增加，丹酚酸B含量减少，综合以上分析以及节能考虑，确定复方四参颗粒剂的水提工艺8倍量水，提取2次，第一次时间为2 h，第二次时间为1 h。

图1 对照品和复方四参颗粒剂的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances and Fufang Sishen granular formulation

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

表3 干膏得率方差分析Table 3 Results of analysis of variance of dry extract

F0.05(2，2)=19，F0.01(2，2)=99

表4 丹酚酸B含量方差分析Table 4 Results of analysis of variance of salvianolic acid B

2.7 最佳工艺的验证

平行称取3份处方药材，按照最佳工艺提取并制备相应的样品，测定干膏得率、丹酚酸B含量。结果表明，其平均干膏得率为16.58%，丹酚酸B的平均含量为22.42 mg。验证结果与正交实验结果基本一致，表明该工艺稳定、可行。

3 讨论

复方四参颗粒剂是医院制剂，在长期的临床实践中证明其疗效显著，但是一直没有具体的质量标准。太子参为本方君药，但其所含化学成分无含量测定对照品，无法对其进行质量控制。选用丹参中的丹酚酸B为含量测定指标成分，其含量测定方法成熟、可靠，可以为复方四参颗粒制剂的质量控制标准提供参考。

根据文献［4，5］和预试验，影响复方提取工艺效果的主要因素是溶剂用量、煎煮次数和煎煮时间等。对溶剂的选择是依据药材中有效成分都溶于水的性质和临床使用方式多为水煎服的特点。采用水煎煮法提取，通过正交设计综合考虑各因素，结果经直观分析表明:最佳水提取工艺为加8倍量的水，提取2次，每次2 h，但是丹酚酸B为热不稳定成分，故煎煮时间增加，其含量会有所下降，故改为第一次2 h，第二次1h。经验证试验，结果与正交试验相一致，表明该工艺稳定、可行。

丹酚酸B具有很强的抗氧化作用，能清除氧自由基［6］、抑制脂质过氧化反应，对心脏具有较好的保护作用，但是丹酚酸B对热不稳定，长时间暴露在空气中，含量会有所降低。为保证有效成分的提取率，在对提取液的浓缩过程中，需要采用减压浓缩。

1 Wei QH(魏强华)，Shi YY(石蕴玉)，Shen BS(沈博生)，et al.Clinical study on Fufang Sishen decoction in treating arrhythmia after virus myocarditis.J Chin Integr Med(中西医结合学报)，2004，2:97-99.

2 Yao HJ(姚慧娟)，Hu DD(胡道德)，Jin J(金剑)，et al.Determination of verbascoside and salvianolic acid B in Linqihuangban granules by HPLC gradient elution method.Chin J New Drugs Clin Rem(中国新药与临床杂志)，2010，29:123-126.

3 Ji QY(季巧遇)，Li YG(李诒光)，Liu XH(刘旭海)，et al．Optimization of extraction technology of Jianwei Xiaoshi orally disintegrating tablet by orthogonal test.Chin J Exp Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志)，2011，17:512-15.

4 Du ZL(杜中良)，Cheng ZT(程振田).Optimization of the extraction technology of salvianolic acid B from salvia miltiorrhiza by orthogonal experiment.China Pharm(中国药房)，2010，21:2911-2912.

5 Li SL(李绍林)，Zhang JJ(张建军).Optimization of extracting technology of Salviae miltiorrhizae.Chin J Exp Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志)，2011，17:45-47.

6 Wang SP(王舒平)，Wang YY(王艳艳)，Yin CN(尹彩娜)，et al.Effect of salvianolic acid B on digestive system ROS level in high sugar dietary mice.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2009，21:948-951.