银杏达莫注射液抑制大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的机制研究*

王 静, 姜玉新, 崔凤娟, 闵志雪, 周萍萍, 王海华

(皖南医学院生理教研室, 安徽 芜湖 241002)

银杏达莫注射液抑制大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的机制研究*

王 静, 姜玉新, 崔凤娟, 闵志雪, 周萍萍, 王海华△

(皖南医学院生理教研室, 安徽 芜湖 241002)

目的观察银杏达莫注射液预处理对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的影响，并探讨其可能的作用机制。方法SD雄性大鼠40只随机分成5组(n=8)：正常对照(NC)组、缺血/再灌注(I/R)组、缺血预处理(IPC+I/R)组、银杏达莫注射液预处理(GD+I/R)组和银杏达莫+氯化镧预处理(GD+LaCl3+I/R)组。观察各组相同时点(预灌30 min稳定点，缺血30 min，再灌5 min、30 min、60 min)的心功能指标,包括心率(HR)、左室收缩压(LVSP)和室内压变化速率(±dp/dtmax)，同时收集各时点冠脉流出液，检测其中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性。实验结束后检测心肌线粒体Ca2+浓度和α-酮戊二酸脱氢酶(α-OGDH)含量。结果与I/R组比较，IPC+I/R组和GD+I/R组在心脏再灌注期各项心功能指标均得到改善(P<0.05)；心肌LDH和CK的释放量降低(P<0.01)；线粒体内Ca2+超载降低(P<0.01)，且线粒体内α-OGDH含量升高(P<0.05)；而GD+I/R组中银杏达莫对心肌的保护作用被LaCl3抑制(P<0.05)。结论银杏达莫可能通过抑制钙超载、增强线粒体酶活性以稳定线粒体能量代谢，从而缓解缺血/再灌注诱导的心肌细胞损伤。

银杏达莫注射液； 氯化镧； 缺血/再灌注损伤； 钙超载； 线粒体

缺血性心脏病(ischemic heart disease, IHD)是严重威胁人类健康的疾病，也是我国死亡率最高的疾病之一，而缺血后的再灌注又会对心肌产生严重的损伤，即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤，细胞内钙超载是I/R损伤发生的最重要机制之一。细胞内Ca2+一直作为重要的第二信使发挥作用，但是钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)的发现使人们认识到，Ca2+可以作为第一信使与细胞膜上的CaSR结合，引起胞内钙库释放Ca2+从而升高细胞内Ca2+浓度。大量研究证实CaSR参与了I/R损伤细胞内Ca2+超载，并且通过1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)通路引起肌浆网内钙耗竭通过线粒体-肌浆网膜引起线粒体内钙的变化从而诱发线粒体凋亡通路的活化[1-3]。银杏达莫(ginkgo-dipyridamole, GD)是我国第4代银杏叶提取物加入双嘧达莫的复合制剂，因其具有保护血管内皮，调节机体代谢和末梢血液循环障碍等功效而广泛应用于冠心病、血管栓塞、糖尿病等疾病的预防和治疗；但目前尚未见到以GD作为预处理，研究其对I/R损伤心肌及线粒体的作用。本实验采用Langendorff 离体心脏灌流技术，观察银杏达莫注射液对离体心脏缺血/再灌注损伤的影响，并探讨其可能的作用机制。

材 料 和 方 法

1动物

SD雄性大鼠，体重(250±30)g，动物合格证号为SCXK(浙)20080033。

2主要试剂

乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase，α-OGDH)和Ca2+试剂盒购自南京建成生物工程研究所；氯化镧(lanthanum chloride,LaCl3)购自Sigma; 银杏达莫注射液为贵州益佰制药公司生产，其余试剂均为国产分析纯。

3主要设备

Langendorff离体心脏灌流装置和Medlab/8C生物信号采集系统(南京美易科技有限公司)，紫外分光光度计(UV-3200PCS)，Model-680型酶标仪(Bio-Rad)。

4主要方法

4.1实验分组 实验动物共40只，随机分5组(n=8)：(1)正常对照(normal control, NC)组，灌注全程均用富氧Krebs-Henseleit(K-H)液(118.4 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，1.1 mmol/L MgSO4，1.18 mmol/L KH2PO4，4.5 mmol/L NaHCO3，2.55 mmol/L CaCl2，11.1 mmol/L glucose，pH 7.4，充以95% O2和5% CO2的混合气体)在恒温(37 ℃)、恒压(8.33 kPa)条件下灌注；(2)I/R组：富氧K-H液预灌30 min待心功能稳定，全心缺血缺氧30 min，随后用富氧K-H液复灌60 min；(3)缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)+I/R组：富氧K-H液预灌30 min待心跳稳定，行全心缺血缺氧5 min，富氧K-H液再灌5 min，重复3次，随后的方法同I/R组；(4)GD+I/R组：富氧K-H液预灌30 min待心功能稳定，用含银杏达莫注射液(10 mg/L)的富氧K-H液预灌10 min，随后的方法同I/R组；(5)GD+LaCl3+I/R组：富氧K-H液预灌30 min待心功能稳定，用含LaCl3(10 μmol/L)的K-H液预灌10min，随后的方法同GD+I/R组。

4.2实验方法 取健康大鼠，麻醉后迅速开胸取出心脏，置于0～4 ℃ K-H液中，主动脉插管悬挂于Langendorff离体心脏灌流装置上以富氧(充以95%O2+5%CO2)K-H液逆行灌注，在恒温(37 ℃)、恒压(8.33 kPa)条件下，调整灌脉流量为6～8 mL·min-1·g-1心肌。在左心耳剪一小口，用自制的乳胶小球囊放入左心室内，通过Medlab生物信号采集处理系统记录心功能指标，使左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)维持在0～10 mmHg，用富氧K-H液预灌至离体心脏心跳恢复和心功能指标稳定后开始实验。记录各组预灌30 min稳定点，缺血30 min，再灌5 min、30 min和60 min的心功能指标[左室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)、心率(heart rate, HR)和左室内压最大上升/下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure, ±dp/dtmax)]，同时收集各时点的冠脉灌流液，用比色法测定其LDH和CK活性，具体操作按试剂盒说明进行。

4.3线粒体匀浆制备 参照Spector等[4]的方法，实验结束后，取心脏0.2 g，加9倍于心脏重量的预冷匀浆溶液进行匀浆；4 ℃、2 000 r/min离心10 min，取上清，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，沉淀物即为线粒体。将线粒体用20倍的预冷匀浆溶液制备成混悬液，用比色法测定Ca2+浓度，ELISA法检测线粒体α-OGDH含量，具体操作按试剂盒说明进行。

5统计学处理

使用SPSS 16.0统计软件处理。数据以均数±标准差(mean±SD)来表示，组间均数比较用单因素方差分析,以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1银杏达莫对离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤心功能的作用

从表1组内结果看，I/R组在再灌5 min心功能恢复，但再灌30 min时心脏做功量(LVSP×HR)降低(与再灌5 min比较，P<0.05)，再灌60 min时做功量明显降低(与再灌5 min比较，P<0.01)，说明出现了再灌注损伤。IPC+I/R组和GD+I/R组再灌30 min和60 min的做功量与再灌5 min相比均没有出现明显的降低；GD+LaCl3+I/R组再灌30 min做功量与再灌5 min相比没有降低，但再灌60 min后做功量出现下降(与再灌5 min比较，P<0.05)。结果提示：I/R组再灌注过程中出现了心功能损伤；GD与IPC均缓解了缺血/再灌注心功能损伤，其机制可能与抑制细胞钙超载，稳定线粒体能量代谢有关；加入LaCl3后，对心脏的保护作用有所降低。

表1显示各组间心脏的做功量(LVSP×HR)在心脏稳定点均未见明显差异；缺血30 min后，与NC组相比，I/R组、IPC+I/R组、GD+I/R组和GD+LaCl3+I/R组心脏做功量均明显降低(P<0.01)。与I/R组相比，再灌5 min时，IPC+I/R组和GD+I/R组做功量已开始恢复(P<0.05)，再灌30 min和60 min时均已明显恢复(P<0.01)；但GD+LaCl3+I/R组做功量的恢复在再灌5 min时未见改善，而到再灌30 min至60 min时均出现改善(P<0.05)。加入10 μmol/L 的LaCl3后，GD+LaCl3+I/R组的做功量与GD+I/R组相比在再灌60 min差异显著(P<0.05)。结果提示：GD与IPC类似，在再灌初期(5 min)即可使心肌损伤得到改善，加入LaCl3后，对心肌的保护效应被推迟，至再灌30 min才出现明显结果，其机制可能与LaCl3增加了细胞内及线粒体内Ca2+浓度有关。

±dp/dtmax的结果显示，I/R组再灌5 min时±dp/dtmax恢复，但再灌30 min时±dp/dtmax降低(与再灌5 min比较，P<0.05)，再灌60 min时±dp/dtmax明显降低(与再灌5 min比较，P<0.01)，说明再灌注引起心肌细胞收缩能力的减弱。各组间在心脏稳定点无显著差异(P>0.05)，缺血缺氧30 min后，与NC组相比，I/R组、IPC+I/R组、GD+I/R组和GD+LaCl3+I/R组的+dp/dtmax均明显下降(P<0.01)。与I/R组相比，再灌5 min和30 min后，IPC+I/R组和GD+I/R组的+dp/dtmax已开始恢复(P<0.05)，再灌至60 min时已明显恢复(P<0.01)；但加入10 μmol/L LaCl3后，GD+LaCl3+I/R组的+dp/dtmax直至再灌60 min时才开始恢复(P<0.05)。而与GD+I/R组相比，GD+LaCl3+I/R组的+dp/dtmax在再灌30 min和60 min均差异明显(P<0.05)。再灌过程中，各组心肌的-dp/dtmax的变化与+dp/dtmax的变化略有不同，如再灌5 min时，IPC+I/R组、GD+I/R组和GD+LaCl3+I/R组的-dp/dtmax恢复程度与I/R组相比无明显区别，而再灌30 min及60 min时出现差异(P<0.05)。结果提示：GD和 IPC能改善I/R过程心肌收缩能力及心肌顺应性，加入LaCl3后，心肌收缩能力和顺应性的恢复有所降低。

表1 银杏达莫对离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤心功能的作用

*P<0.05，**P<0.01vsNC group at the same point；#P<0.05，##P<0.01vsI/R group at the same point；&P<0.05vsGD+I/R group at the same point；△P<0.05，△△P<0.01vsreperfusion 5 min in the same group.

2冠脉流出液中LDH和CK活性的变化

表2显示，经过全心缺血缺氧30 min后，各组冠脉流出液中LDH和CK活性都随时间推移逐渐升高，特别是I/R组再灌30 min与再灌5 min已出现显著差异(P<0.05)，至再灌60 min已达显著差异(P<0.01)。与NC组相比，缺血30 min时，I/R组、IPC+I/R组、GD+I/R组和GD+LaCl3+I/R组LDH和CK活性均升高(P<0.05)。与I/R组相比，再灌5 min， IPC+I/R组、GD+I/R组和GD+LaCl3+I/R组的LDH和CK活性无显著差异(P>0.05)；再灌30 min，IPC+I/R组和GD+I/R组的LDH和CK活性降低(P<0.05)，且再灌60 min时其活性明显降低(P<0.01)；GD+LaCl3+I/R组的LDH和CK活性到再灌60 min出现差异(P<0.05)，见图1。结果提示,再灌过程各组心肌均出现损伤，表现为细胞内酶(LDH和CK)的外漏，GD和IPC抑制了再灌注过程中心肌细胞内酶的外漏，但其效果在再灌初期并不明显，到再灌30 min才出现明显结果；加入LaCl3抑制酶外漏的效果减弱，到再灌60 min才出现明显效果。

表2 冠脉流出液中LDH和CK活性的变化

*P<0.05，**P<0.01vsNC group at the same point；#P<0.05，##P<0.01vsI/R group at the same point.

3线粒体Ca2+浓度的组间变化

与NC组相比，I/R组心肌线粒体内明显出现钙超载(P<0.01)；与I/R组相比，IPC+I/R组和GD+I/R组钙超载现象明显得到缓解(P<0.01)，GD+LaCl3+I/R组钙超载现象也得到缓解(P<0.05)；加入10 μmol/L LaCl3后，GD+LaCl3+I/R组的Ca2+浓度比GD+I/R组高(P<0.05),见图1。结果提示：GD和IPC能抑制缺血/再灌注造成的线粒体钙超载，其机制可能是抑制了细胞外Ca2+内流或者调节线粒体储Ca2+能力；而且GD抑制钙超载的作用在加入LaCl3后被减弱。

4线粒体α-OGDH含量的组间变化

NC组的α-OGDH含量处于较高水平，I/R组线粒体α-OGDH含量明显降低(P<0.01)；与I/R组相比，IPC+I/R组和GD+I/R组α-OGDH含量明显恢复(P<0.01)，GD+LaCl3+I/R组α-OGDH含量也有恢复(P<0.05)；加入10 μmol/L LaCl3后，GD+LaCl3+I/R组的α-OGDH含量比GD+I/R组有所降低(P<0.05)，见图2。结果提示,GD和IPC能增加再灌注损伤后线粒体内能量代谢关键酶含量，其机制可能与稳定线粒体内Ca2+水平有关。

Figure 1. Changes of Ca2+concentration in mitochondria.Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsNC group;#P<0.05，##P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsGD+I/R group.

图1线粒体Ca2+浓度的变化

Figure 2. Changes of the content of α-OGDH in mitochondria.Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsNC group;#P<0.05，##P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsGD+I/R group.

图2线粒体α-OGDH含量的变化

讨 论

心肌I/R损伤在各类心脏手术(如心脏移植、心跳骤停复苏及冠脉溶栓术等)中都有发生，但I/R损伤的病理生理机制尚未完全阐明。已有证据表明，再灌注启动的最初数分钟内即可出现细胞内钙超载、线粒体能量合成障碍、氧自由基生成等现象[5]。通过缺血前的多次短暂的缺血-再灌措施即缺血预处理可通过降低细胞内钙超载、改善内皮功能、减少中性粒细胞聚集等机理而有效地保护心肌[6-8]。CaSR属于G蛋白偶联受体C家族成员，主要功能是维持细胞内Ca2+和其它金属离子的稳态。细胞外的Ca2+、其它多价阳离子(Gd3+、Mg2+、La3+等)、多胺、L-氨基酸等均可激活CaSR，CaSR激活后可以通过IP3通路引起肌浆网释放Ca2+，引起细胞内Ca2+浓度升高，进而损伤线粒体并诱发细胞凋亡。CaSR在心肌I/R损伤中发挥关键作用，通过激活MAPKs-CytC-caspase-3通路和Fas受体死亡通路，诱导心肌细胞凋亡[9-11]。

心脏正常收缩和舒张功能对维持正常的血流动力有重要的意义。LVSP和+dp/dtmax可反映心肌最大收缩能力，-dp/dtmax反映心肌的最大舒张力，是衡量心肌舒张顺应性的指标，HR从整体反映心脏的工作性能。心肌缺血/再灌注会导致心肌舒缩功能的降低，表现为持久的心输出量减少以及±dp/dtmax降低等[12]。本研究发现银杏达莫使再灌注期的LVSP和±dp/dtmax均明显升高，说明银杏达莫能使I/R损伤时心肌收缩能力增强，改善心肌顺应性。缺血/再灌注损伤时，线粒体能量代谢障碍与钙超载和氧自由基的产生互为因果，共同加剧了细胞的不可逆损伤，如细胞损伤和死亡、细胞内酶外漏(如LDH和CK)等[13-16]，而α-OGDH对线粒体的能量代谢和活性氧生成起着重要作用[17-18]。在I/R损伤时，由于细胞缺氧导致α-OGDH的含量降低[19]。本研究发现银杏达莫可降低I/R损伤期间LDH和CK的外漏，同时提高了α-OGDH的含量，以缓解I/R所诱导的心肌损伤。银杏达莫对I/R损伤心肌的保护作用可以被CaSR激动剂LaCl3抑制，因此我们推测银杏达莫对I/R损伤心肌的保护可能与降低细胞内Ca2+浓度密切相关，通过调节Ca2+水平来稳定线粒体能量代谢从而延缓细胞凋亡。

综上所述，本研究证实银杏达莫可以通过抑制钙超载、增强线粒体酶活性以稳定线粒体能量代谢，从而缓解缺血/再灌注对心肌细胞的损伤，而这种保护效应是否是银杏达莫作为钙通道阻断剂而发挥作用，有待进一步研究。

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Inhibitoryeffectofginkgo-dipyridamoleinjectiononischemia/reperfusioninjuryinratheartsinvitro

WANG Jing, JIANG Yu-xin, CUI Feng-juan, MIN Zhi-xue, ZHOU Ping-ping, WANG Hai-hua

(DepartmentofPhysiology,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China.E-mail:wanghaihua9972@sina.com)

AIM: To investigate the effect of ginkgo-dipyridamole injection (GD) on ischemia/reperfusion (I/R) injury in rat heartsinvitroand its possible mechanism.METHODSForty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups (n=8): normal control (NC) group, I/R group, ischemic preconditioning (IPC)+I/R group, GD+I/R group and GD+LaCl3+I/R group. Cardiac function indexes, including heart rate (HR), left ventricular systolic pressure (LVSP) and the maximal rise/fall rate of left ventricular pressure (±dp/dtmax), were detected at 5 time points, including stabilizing point, 30 min after ischemia, and 5, 30 and 60 min after reperfusion. The activity of lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) in coronary effluent at the five time points was assayed. The concentration of Ca2+and the content of α-ketoglutarate dehydrogenase (α-OGDH) in myocardial mitochondria were determined at the end of the whole experiment.RESULTSCompared with I/R group, the cardiac function indexes in IPC+I/R and GD+I/R groups were improved at the reperfusion period (P<0.05), the activity of LDH and CK in coronary effluent and the concentration of Ca2+in mitochondria were significant reduced (P<0.01), and the content of α-OGDH was increased (P<0.05). However, the protective effect of GD was inhibited by LaCl3(P<0.05).CONCLUSIONGD protects rat hearts against I/R injury by inhibiting calcium overload and improving mitochondrial enzyme activity to stabilize mitochondrial energy metabolism.

Ginkgo-dipyridamole injection; Lanthanum chloride; Ischemia/reperfusion injury; Calcium overload; Mitochondria

中国病理生理学会2013年活动计划表

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1573- 06

2013- 04- 15

2013- 06- 28

国家自然科学基金资助项目(No.81172790);安徽省自然科学研究重点基金资助项目(No.KJ2013A251);皖南医学院中青年基金资助项目(No.WK201310);皖南医学院重点科研基金资助项目(No.WK2012Z01)

△通讯作者 Tel： 0553-3866058; E-mail: wanghaihua9972@sina.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.006