高效液相色谱研究式教学实验的设计与实践

孙大贵， 刘作华， 李文坡， 陈昌国

(重庆大学化学化工学院，重庆 400044)

0 引言

高效液相色谱法(HPLC)具有分离效能高、选择性好、检测灵敏度高、分析速度快等特点，已经成为商品检验、环境科学和生命科学等领域科学研究、科学鉴定的重要分离分析手段[1]，被列为高校本科及研究生仪器分析实验课程的实验项目之一[2-3]。但几乎都是在固定色谱条件下进行定量分析的传统实验教学模式，缺乏创造性的探索过程。且实验课时有限，一般只有4～8学时，学生对HPLC分析方法只能走马观花，达不到良好的教学效果[4]。

高效液相色谱仪属于大型精密仪器，数量有限，运行、维护成本高，对实验操作的技能技巧要求较高，所以，对教师和学生的开放程度相对有限[5-6]。“虚拟实验室”的开发应运而生，成为众多高校实验教学，尤其是仪器分析课程教学改革的新发展方向之一[7]。但却失去了师生之间面对面互动式的教学相长机会，更不可能达到熟练操作的目的[8]。因此，很有必要设计具有启发式、探究式、讨论式、科研与教学互动的HPLC教学实验[9]。

由于科研工作的需要，作者探索了用高效液相色谱法测定混合邻苯二甲酸酯的方法[10-11]，并将其改编成仪器分析的研究式教学实验。具体包括了色谱柱效的测定、色谱条件优化、定量分析3个实验项目，其中“色谱条件优化”最具代表性。

1 实验器材

(1)仪器。Agilent 1100高效液相色谱仪，色谱柱Hypersil ODS(4.6 mm×150 mm)，固定相颗粒度5 μm，MWD检测器，高压六通进样阀，定量管20 μL。

(2)流动相。乙腈(色谱纯)，超纯水。

(3)标准溶液。浓度均为10 μg/L的邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)溶液。均为分析纯。

2 教学过程

2.1 课题引入

邻苯二甲酸酯 (Phthalic Acid Esters，PAEs)是一类应用广泛的合成有机物。近年来，研究发现邻苯二甲酸酯类化合物极难降解，在体内长期累积，严重干扰人类和动物的内分泌系统，具有致突变、致癌和致畸形的作用，因此，有关环境中邻苯二甲酸酯类污染物的控制和治理引起了人们的高度重视。其中6种被美国环境保护署列为优先控制的环境污染物，我国环境保护部也将其中3种列为优先控制的环境污染物，并发布了采用正相液相色谱法测定的标准[12]。

讨论1:正相液相色谱法与反相液相色谱法各有什么特点?

小结:在正相色谱法中，固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。在反相色谱法中，固定相的极性小于流动相的极性，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37(简称ODS或C18)、硅胶-苯基等，用极性溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。水、甲醇、乙腈的稳定性好，紫外吸收截止波长小、紫外吸收低、粘度低、互溶性好、混合溶剂的极性可以在很大范围内调整，应用范围比正相色谱法更广泛，可以解决80%的液相色谱分析课题[13]。本实验将探索采用反相液相色谱测定邻苯二甲酸酯类化合物的方法。

2.2 实验条件的设定和优化

在色谱柱选定的前提下，需要设置的条件主要有柱温、检测器波长、流动相组成、流动相流量等。柱温一般以略高于室温为宜:30℃，流动相流量一般为1.0 mL/min，MWD波长:228 nm。而流动相组成对实验结果的影响最大，一般应根据实验探索。

讨论2:流动相组成初始值应如何设置?

小结:初始试验点事先不知道的情况下，在选点方法、试验次数，黄金分割法具有最优性[14]，这种方法能以较少的实验次数，迅速找到最优方案，因而是一种常用的优选法。根据“黄金分割法”优选(即0.618法)，将流动相中乙腈/水的组成初始值设为62/38。实验结果如图1所示。

讨论3:色谱分析方法的优劣如何评价?

小结:根据色谱图可以大致判断分析方法的优劣:①分离度。谱峰数应与组分数相对应，即样品中有几个组分就应该有几个峰，每个组分是否达到基线分离;②峰形。峰形尖锐、对称(无前伸或拖尾)、大信噪比的窄峰最好，有利于提高定性、定量的准确性、重现性;③分析速度。出峰时间的分布是否均匀，总体分析速度是否快。由图1可见，分离度很好，但峰3较宽，出峰时间较慢、且与峰2相距较远，分析时间14 min左右，因此，需要进行优化。

图1 流动相乙腈/水为62/38的色谱图

讨论4:色谱分析方法的优化应如何着手?

小结:色谱分析方法的优化，可以通过改变固定相、流动相、温度等条件来实现。在色谱柱选定的前提下，流动相的组成与配比，是色谱系统分离性能的关键。优化的目标是在保证一定分离度的条件下，实现分析速度的最优化，或在保证一定分析时间的条件下，实现难分离物质对分离度的最优化。

根据实验结果，应增加流动相淋洗强度，因为反相液相色谱法的固定相为非极性，根据“相似相溶”原理，应增加弱极性溶剂乙腈的含量，根据“黄金分割法”0.618+0.382 ×0.618=85，因此将流动相乙腈/水的组成设为85/15。实验结果如图2所示。

图2 流动相乙腈/水为85/15的色谱图

由图2可见，峰3的峰形得到了改善，分析时间缩短到7 min左右，但峰1、峰2的分离度变差，因此，需要进一步优化。

讨论5:能否继续改变乙腈/水组成的方法优化?

小结:当样品中所含组分的极性或其它性质相差较大时，若采用等度洗脱，有时不能使所有的组分都得到较好的分离，或保留强的组分的出峰时间相差太远。这时可采用梯度洗脱的方法，即在分析过程中，按一定程序不断改变流动相的浓度比，从而使一个复杂样品中性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子达到良好的分离，使保留强的组分在保证充分分离的前提下，尽快流出分离柱，缩短分析时间。

讨论6:梯度洗脱的流动相条件应如何设置?

小结:液相色谱梯度洗脱的比等度洗脱复杂得多，是色谱流动相选择性优化的难点，要考虑梯度洗脱模式和梯度洗脱程序两个问题。梯度洗脱模式分为线性梯度和非线性梯度，非线性梯度又分为曲线梯度、分段梯度、台阶梯度，其中线性梯度优点是基线平滑，程序设计较简单，是初试实验的首选。至于梯度洗脱程序的设计，可以借鉴以上两个实验结果，对于峰1、峰2乙腈/水为62/38左右为宜，考虑到线性梯度过程中乙腈/水的比例是逐渐增大，因此，乙腈/水的组成初始值设为50/50，对于峰3乙腈/水应大于85/15，因此，梯度洗脱程序设为0～8 min乙腈/水的组成从50/50变化到100/0。实验结果如图3。

图3 梯度洗脱的色谱图

从图3可见，分析周期缩短，分离度高，所有峰形令人满意。实验探索获得成功。

讨论7:梯度洗脱应注意哪些问题?

小结:梯度洗脱时，由于流动相的混合、组成不断变化，因此，在设计实验时，应注意以下问题:①为保证良好的重现性，梯度洗脱对仪器的性能要求更高;②对溶剂纯度也有更高的要求，还要注意溶剂的互溶性，有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。当使用缓冲溶液时应注意与有机溶剂混合时可能会析出盐的结晶体;③ 连续使用时，每次进样梯度洗脱后，须增加对色谱柱进行再生处理程序，使其恢复到初始的状态。

3 结语

由于现代分析仪器与计算机的联用，智能化、自动化程度越来越高，色谱工作站的功能越来越强大，但计算机毕竟是“机”，电脑永远不能代替人脑，色谱分析属于多因素多目标的体系，寻求优化的实验条件常常是建立色谱分析方法最困难的步骤，特别是液相色谱分析，可谓“法无定法”，没有任何现成的方法可以照抄，任何色谱方法的建立和优化，最终都得靠实验探索来完成。

设计性实验是实验教学改革的重要举措，是提高学生的实验技能、实验素质和创新能力的有效途径[15]，教学和科研相结合，理论和应用相结合，是促使一个优秀实验形成的重要基础[16]，教学中要坚持以学生为本，注重创造师生之间的互动氛围，激发学生对实验的兴趣，合理的安排时间，在有限的时间内，增大信息量，充分发挥学生的主动性和创造性，训练学生的科学思维方法，提高综合分析和解决问题的能力。

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