氯睾酮人工抗原的合成与鉴定

王方明,邹小娟,程亮,姜金庆

（1.新乡市动物卫生监督所,河南新乡453000；2.河南科技学院,河南新乡453003）

氯睾酮（clostebol,CLO）又名氯司替勃,是一种蛋白同化激素甾体药物,具有蛋白同化激素活性,能增加畜禽瘦肉增长,降低脂肪贮积能力,进而提高饲料转化能力和瘦肉生产率,19世纪50年代以后在畜禽养殖领域曾被大量使用[1].体育运动员服用氯睾酮及其代谢物后,可提高体内雄性激素荷尔蒙的含量,进而在比赛中获得不正当的竞技成绩[2].19世纪70年代和80年代,一系列食品安全事故的出现,使肉制品中激素残留问题和人类健康联系起来.研究表明,这些蛋白同化雄性激素会影响人的肝脏功能,损害心血管系统,甚至造成生殖系统障碍、内分泌机能功能受损等毒副作用.因此,自1986年开始,欧盟委员会就禁止畜禽育肥时使用蛋白同化激素类药物,我国农业部2002年发布的《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中也明确规定,性激素类原料药及其单方、复方制剂不准以提高饲料报酬、促进动物生长为目的而在畜禽生产过程中使用[3].

目前,国内外尚未有公开发表的稳定、可靠的氯睾酮残留免疫学检测方法.氯睾酮的相对分子质量为322.87,属于半抗原生物小分子,不能直接刺激动物机体产生特异性抗体,只有与载体蛋白偶联后才具有免疫原性.本研究采用碳化二亚胺法（EDC）制备氯睾酮人工抗原,并进行性能和质量鉴定,为免疫学检测方法的建立和研制氯睾酮残留ELISA试剂盒奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

氯睾酮（CLO）标准品购自德国Dr公司；弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）、碳化二亚胺（EDC）为Pierce产品；琥珀酸酐、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）为Sigma公司产品；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自日本株式会社；羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP）购自华美生物工程有限公司；透析袋（8000-14000）为Solarbio产品；96孔聚乙烯酶标板购自海门博阳实验器材厂；四甲基联苯胺（TMB）、非那西丁、过氧化脲等为Sigma产品.其他所有试剂和溶质均为分析纯,特殊说明除外.

1.2 仪器与设备

Multiskan MK3酶标仪购自美国Thermo公司；DU800核酸蛋白分析仪购自美国Beckman-Coulter公司；TENSOR27红外光谱仪为德国BRUKER公司产品；SZ-97自动三重蒸馏水器购自上海雅荣生化仪器有限公司；eLINE微量移液器为芬兰百得公司产品.

1.3 人工抗原的合成

[4],采用优化的EDC两步法合成氯睾酮（CLO）人工抗原（见图1）.用电子天平准确称取CLO 58 mg溶于3 mL无水吡啶,充分溶解后加入90 mg琥珀酸酐,室温条件下,避光振荡反应24 h.然后用氮吹仪吹干吡啶,制得淡黄色油脂状化合物.将脂状物用质量分数为5%的NaHCO3溶液溶解,乙醚洗涤,再用H2SO4酸化后离心.弃上清液,残留物用无水硫酸钠干燥,将溶剂挥发干净后,得到淡黄色固体状物,即为氯睾酮琥珀酸酯.将40 mg氯睾酮琥珀酸酯用3 mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解后,加入38 mg EDC和12 mg NHS,37℃条件下避光,摇床振荡反应24 h.反应结束后离心,取上清液逐滴加入到5 mL含66 mg BSA（或40 mg OVA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中,转子搅拌反应6 h.反应完成后,将液体装入透析袋,先用蒸馏水透析3 d,再用PBS透析3 d.结束后,冻干保存制备的氯睾酮免疫原（CLO-BSA）及氯睾酮检测抗原（CLO-OVA）.

1.4 人工抗原的鉴定

1.4.1 紫外扫描鉴定 用含8%甲醇的PBS缓冲液配制CLO与BSA标准品.接着取0.5 mg的CLO-BSA免疫原溶于PBS中,用紫外分光光度法测定BSA的浓度和特征吸收峰,并调节CLO-BSA免疫原的蛋白质浓度与BSA标准溶液一致,在220—400 nm波长范围内进行紫外全扫描,根据吸收峰的变化特点判断偶联是否成功,并计算蛋白质与CLO的分子结合比[5-6].

1.4.2 红外光谱法鉴定 彻底透析后的CLO-BSA免疫原、BSA、CLO半抗原作红外光谱检测.取样品2 mg,加入干燥的KBr置于玛瑙乳钵中,在红外灯照射下研磨、混匀,装压片模具,在8 000 N压力下加压10 min,制得厚度1 mm的透明KBr样品晶片,上机检测[7].

1.4.3动物免疫试验 选择6～8周龄雌性Balb/C小鼠5只,进行人工抗原免疫试验.免疫剂量为60 μg/只,注射体积为0.2 mL,采用颈背部皮下多点注射法.首免使用PBS缓冲液稀释CLO-BSA免疫原,然后与等体积的FCA完全乳化；以后每隔3周注射1次,乳化剂更换为FIA,总计强化免疫4次.每次免疫后10 d,小鼠尾部采血分离血清,用间接ELISA和间接竞争ELISA（icELISA）进行抗体效价和灵敏度测定[8].

2 结果与分析

2.1 紫外扫描鉴定结果

氯睾酮半抗原、载体蛋白BSA及免疫原CLO-BSA的紫外光谱见图2.

由图2可知,CLO半抗原在285 nm和345 nm处有典型吸收,BSA在275 nm及280 nm处有最大吸收峰,而CLO-BSA免疫原的最大吸收峰则位于274 nm及278 nm处,这说明氯睾酮人工抗原偶联物最大吸收峰左移,并与其前体物质有不同的紫外吸收特征,初步表明偶联成功.根据公式计算出BSA与CLO的分子结合比为16.5∶1.

2.2 人工抗原的红外光谱分析

氯睾酮标准品、BSA和免疫原红外鉴定结果见图3.

由图3可知,BSA和CLO-BSA免疫原在2 500～3 200 cm-1和1 660～1 500 cm-1的区域内具有相似的吸收峰,这是BSA中氨基酸的特征峰,说明合成的免疫原中含有BSA.氯睾酮标准品在3 300 cm-1处有一个强吸收峰,这是羟基的特征峰,而人工抗原CLO-BSA无此吸收峰,表明半抗原衍生化成功.同时,CLO-BSA和CLO标准品在2 800 cm-1有相似的吸收峰,而BSA在此处无吸收峰,证明CLO-BSA中含有CLO.据此确定CLO-BSA人工抗原偶联成功.

2.3 动物免疫试验结果

CLO-BSA免疫Balb/C小鼠,经4次加强免疫后,利用CLO-OVA做包被抗原,进行间接ELISA测定小鼠抗血清效价,结果见表1.

表1 间接ELISA效价检测结果Tab.1 Titer results by indirect ELISA

由表1可知,3只小鼠均获得了较高的抗体效价,效价分别为1.6×104、3.2×104和1.6×104,其中最好的血清抗体为2号小鼠.采用不同浓度的CLO标准品作竞争抑制物,对2号小鼠抗血清进行间接竞争ELISA试验,结果见表2.

表2 间接竞争ELISA检测抗体灵敏度Tab.2 Sensitivity ofantibody by indirect competitive ELISA

由表2可知,随着CLO标准品浓度的增加,ELISA显色效果逐渐降低,证实CLO能阻断上述反应的发生,表明小鼠抗血清中含有针对CLO的特异性抗体.2号小鼠血清抗体灵敏度为64 ng/mL.

3 结论

本研究采用EDC两步法成功合成了氯睾酮人工抗原,免疫Balb/C小鼠制备出高效价的抗血清.抗体的亲和力强、灵敏度高,可满足动物源性食品中氯睾酮检测的监管需求.氯睾酮人工抗原的合成为建立动物源食品中CLO免疫学检测方法及开发ELISA快速检测试剂盒奠定了基础.

参考文献：

[1]姜金庆,张海棠,王自良,等.19-去甲类固醇激素检测方法研究进展[J].生物技术通报,2010,12（4）：93-98.

[2]Masayuki Y,Sugako A,Masahiko K,et al.Simultaneous doping analysis ofmain urinary metabolites ofanabolic steroids in horse by ion-trap gas chrtography-tandem mass spectrometry[J].Analytical Sciences,2008,24（9）：1199-1205.

[3]Jiang J Q,Zhang H T,Li G L,et al.Establishment and optimization of monoclonal antibody-based heterologous dcELISA for 19-nortestosterone residue in bovine edible tissue[J].Journal of Food Science,2012,77（4）：63-69.

[4]李超英,姜金庆,李凤云,等.睾酮多克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立[J].湖北农业科学,2012,51（16）：3554-3556.

[5]李伟岭,岳永波,李金明,等.沃尼妙林人工抗原的合成与鉴定[J].中国兽医杂志,2012,48（2）：78-80.

[6]袁利鹏,孙远明,雷红涛,等.沙丁胺醇人工抗原合成及鉴定研究[J].食品科学,2006,27（12）：276-280.

[7]王自良,王建华,张海棠,等.苯巴比妥多克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定[J].中国兽医杂志,2006,42（5）：12-14.

[8]包晓玮,韩海霞,景伟文,等.四环素全抗原的合成及多克隆抗体的制备[J].广东农业科学,2010（5）：171-173.