肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因突变与喹诺酮耐药相关性研究

张友春，王志平

(1.淳安县妇幼保健院，浙江 淳安 311700；2.浙江医学高等专科学校，浙江 杭州 310053)

·基础与临床研究·

肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因突变与喹诺酮耐药相关性研究

张友春1，王志平2@

(1.淳安县妇幼保健院，浙江 淳安 311700；2.浙江医学高等专科学校，浙江 杭州 310053)

目的：分析浙江省淳安县肺炎克雷伯菌临床菌株gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变类型及与耐药的相关性。方法检测87株肺炎克雷伯菌临床菌株对3种喹诺酮类药物的最小抑菌浓度(MIC)，PCR扩增26株临床菌株的gyrA 和parC基因并测序。结果87株临床菌株对诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为58.6%、55.2%和51.7%。16株耐药株全部发生gyrA基因S83突变，9株发生parC基因的S80突变，MICs范围16～≥128mg/L，7株未发生parC基因的S80突变，MICs范围4～32mg/L。结论gyrA和parC基因突变在淋肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物耐药中起重要作用，parC基因S80位突变与耐药程度密切相关。

肺炎克雷伯菌；gyrA和parC基因/突变；耐药

Abstract：[Objective] To analyze the relationship between the mutations in the quinolone-resistance-determining-region (QRDR)of gyrA and parC genes and the quinolone resistance in K. pneumoniae isolates. [Method] The MICs of 3 quinolone-drugs were determined. PCR and DNA sequencing were conducted to analyze QRDR associated genes of gyrA and parC in 26 isolates. [Result]The resistance rate of the 87 isolates were 58.6%, 55.2% and 51.7% to norfloxacin, ciprofloxacin and levofloxacm, respectively. In gyrA gene, all 16 resistant isolates had mutation of S83. 9 of 16 resistant isolates had mutation of S80 with MICs ranging from 16 to ≥128mg/L. 7 of 16 resistant isolates were not found mutation of S80 with MICs ranging from 4 to 32. [Conclusion] Mutations in gyrA and parC genes play an important role in the development of quinolone resistance in K. pneumoniae. Mutation of S80 in parC gene are closely associated with high quinolone-resistance.

Keywords:K. pneumoniae; gyrA and parC genes/Mutation; drug resistance

临床上一度将喹诺酮类药物作为对肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)引起的感染性疾病的主要药物。然而，喹诺酮耐药肺炎克雷伯菌的出现已越来越普遍[1-2]。肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物的耐药机制复杂，目前认为编码DNA螺旋酶A亚单位gyrA基因及拓扑异构酶ⅣC亚单位parC基因的喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变起了重要作用且存在地域差异[3-4]。为了解本地区肺炎克雷伯菌临床菌株喹诺酮类药物耐药机制，我们收集了87株临床菌株并检测其对3种喹诺酮药物的耐药性，PCR扩增26株临床菌株gyrA和parC基因并直接测序，探讨gyrA和parC基因的QRDR突变与耐药的相关性。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

87株肺炎克雷伯菌临床菌株2010年1月至2012年6月由本院采集检验科分离，肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC10031和PCR阴性对照大肠埃希菌标准株ATCC25922均购自中国药品生物制品检定所。用普通肉汤琼脂(Oxoid)37℃培养细菌。

1.2 药敏试验

琼脂稀释法测定87株临床菌株和标准菌株ATCC10031对诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)[2]。判断标准参考2010年CLSI制定的抗菌药物敏感性标准。

1.3 PCR及测序

以大肠埃希菌标准株和肺炎克雷伯菌标准菌株为阴性对照和阳性对照，各细菌株培养物沉淀中加入25μL 细菌裂解液，充分混匀后沸水浴10 min，10000 rpm离心取2μL上清作为PCR的DNA模板。参考文献[3]设计扩增肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因片段引物。 委托上海Invitrogen公司测序合成引物。PCR参数：94℃ 4min；94℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min。采用PCR纯化试剂盒提纯化PCR产物，委托Invitrogen公司测序。参照已报道的肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因序列进行比较，以确定上述菌株gyrA和parC基因突变情况。

1.4 统计学处理

实验数据采用χ2检验，对检测结果进行比较，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏结果

87株克雷伯菌临床菌株对诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星耐药率分别为58.6%(51/87)、55.2%(48/87)和51.7%(45/87)。

2.2 PCR扩增结果

1.5%琼脂糖凝胶电泳显示26株肺炎克雷伯菌和标准ATCC10031菌株在441和389bp位置均有gyrA和parC基因扩增的目的片段。同样条件下阴性对照大肠埃希菌标准株PCR扩增结果为阴性，此处不显示。

2.3 PCR产物测序结果

ATCC10031标准菌株gyrA基因83位和87位分别为丝氨酸(S)和天冬氨酸(D)，parC基因80位为S。10株敏感株MICs≤0.5mg/L，gyrA基因分别有2株和3株发生S83和D87突变。16株耐药株gyrA基因全部发生S83突变，类型有S83F/I/Y/K，11株发生D87E/A突变。敏感株不存在S80突变，耐药株中9株存在S80I/B突变。9株存在S80突变菌株除1株诺氟沙星和环丙沙星的MIC=16mg/L外其余8株对3种诺酮类药物的MICs ≥32mg/ L，7株不存在S80突变菌株，除2株对诺氟沙星的MIC =32mg/L其余耐药菌MICs≤16mg/L。 见表1。

表1 26株肺炎克雷伯菌临床菌株对3种喹诺酮类药物的MICs及gyrA和parC突变情况

注：S、D、Y、A、E、F、I、K和B分别代表丝氨酸、酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和精氨酸

3 讨论

肺炎克雷伯菌是各医院感染中最常见的病原菌之一，可引起肺部、尿路、血液系统等多部位感染，细菌耐药性已经成为抗感染失败的重要因素[2-4]。我们研究了87株临床菌株对3种对喹诺酮类药物耐药情况，结果耐药率分别为58.6%、55.2%和51.7%，其耐药率与黑龙江徐艳[5]、浙江上虞卜劲松[1]等报道相似，低于安徽郜玉峰等[6]报道，高于浙江义乌陈如昌等[7]报道。提示肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物耐药率较高且存在地区性差异。

文献报道gyrA和parC基因QRDR突变可使各种喹诺酮类药物MIC增加4～8000倍不等[4]。我们的药敏结果10株敏感株对3种药物的MICs≤0.5 mg/L，而同时存在S83、D87和S80突变的菌株MICs ≥128mg/L。26株临床菌株gyrA和parC基因测序结果显示，耐药株与敏感株gyrA基因S83突变发生率差异有统计学意义(χ2=18.5，P<0.05)，提示肺炎克雷伯菌gyrA基因S83突变发生与喹诺酮类药物耐药密切相关。所有敏感株都不存在parC基因S80突变，耐药株中9株存在S80I或S80B突变，耐药株与敏感株parC基因S80突变发生率差异有统计学意义(χ2=8.6，P<0.05)，提示肺炎克雷伯菌parC基因S80突变发生与喹诺酮类药物耐药密切相关；9株存在S80突变耐药株除1株诺氟沙星和环丙沙星的MIC=16mg/L外，其余8株对3种诺酮类药物的MICs ≥32mg/L，而不存在S80突变的耐药株除2株对诺氟沙星的MIC =32mg/L 外其余耐药菌株MICs≤16mg/ L，提示耐药菌株S80突变可提高肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物耐药程度，这与国外文献报道相似[4]。

[1]卜劲松.201株肺炎克雷伯菌耐药性分析及其gyrA基因分析[J]. 中华医院感染学杂志，2012,22(1)：9-11.

[2]Nesar S, Shoaib MH, Rahim N, et al. Emergence of resistance to fluoroquinolones among gram positive and gram negative clinical isolates. Pak J Pharm Sci. 2012, 25(4):877-881.

[3]Kumar V, Sun P, Vamathevan J, et al. Comparative genomics of Klebsiella pneumoniae strains with different antibiotic resistance profiles. Antimicrob Agents Chemother. 2011, 55(9):4267-4276.

[4]Chen FJ, Lauderdale TL, Ho M et al. The roles of mutations in gyrA, parC, and ompK35 in fluoroquinolone resistance in Klebsiella pneumoniae. Microb Drug Resist. 2003, 9(3):265-271.

[5]徐艳，付英梅，张文莉，等. 肺炎克雷伯菌gyrA基因与parC基因的突变研究[J]. 中国微生态学杂志，2008,20(4)：350-352.

[6]郜玉峰，李家斌.2006-2007年安徽省大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌耐药性监测研究[J]. 中华医院感染学杂志，2009,19(12)：1586-1589.

[7]陈如昌，王利健.2006—2009年重症监护病房医院感染大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌的耐药性分析[J]. 中华医院感染学杂志，2011,21(5)：1013-1015.

TherelationshipbetweengyrAandparCgenemutationsofKlebsiellapneumoniaeandquinoloneresistance

ZhangYouchun1 ，WANGZhiping2@

(1. Maternal and Child Health Hospital of Chunan, Zhejiang 311700,China； 2. Zhejiang Medical College， Huangzhou310053,China)

张友春(1970-)，男，浙江淳安人，本科，主管技师。研究方向：临床医学检验

王志平 hzdwzp99@163.com

R378

A

1672-0024(2013)03-0048-03

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