钙对化学诱抗剂诱导番茄叶片木质素合成的影响

余朝阁， 黄欣阳， 李天来， 刘志恒*

(1 沈阳农业大学园艺学院，设施园艺省部共建教育部重点实验室，沈阳 110161；2 沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110161)

钙对化学诱抗剂诱导番茄叶片木质素合成的影响

余朝阁1, 2， 黄欣阳2， 李天来1*， 刘志恒2*

(1 沈阳农业大学园艺学院，设施园艺省部共建教育部重点实验室，沈阳 110161；2 沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110161)

为探索钙对化学诱抗剂水杨酸(SA)、 茉莉酸甲酯(MeJA)、 龙胆酸(GA)和β-氨基丁酸(BABA)诱导番茄木质素合成的影响，在番茄六叶期用上述诱抗剂分别处理第3叶片，然后喷施CaCl2、 蒸馏水、 乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)或LaCl3，处理后0、 1、 2、 3、 5 d测定各处理番茄第3叶片(诱导叶)和第5叶片(非诱导叶)中木质素含量的变化。结果表明： (1)用上述化学诱抗剂处理番茄第3叶片，诱导叶及其上位非诱导叶中木质素含量均升高；(2)外源Ca2+进一步促进上述诱抗剂诱导番茄叶片中木质素含量的增加；而Ca2+螯合剂EGTA和质膜钙通道抑制剂LaCl3，则不同程度地抑制这些诱抗剂对木质素含量的诱导作用。这些结果表明，钙对上述4种诱抗剂诱导番茄叶片中木质素的合成具有正调控作用。

番茄； 钙； 化学诱抗剂； 木质素

Abstract: The effects of calcium on synthesis of lignin induced by chemical elicitors in tomato were investigated in this study. The 3rd leaves were smeared with chemical elicitors: salicylic acid(SA), Methyl jasmonate(MeJA), β-aminobutyric acid(BABA) and gentisic acid(GA) separately at the six-leaf stage of tomato. After the third leaves dried under room temperature, all the tomato plants were sprayed with CaCl2, distilled water, EGTA and LaCl3in turn. The contents of lignin in the third leaves(induced) and the fifth leaves(un-induced) were determined in 0, 1, 2, 3 and 5 days after treatments. The results show that: (1) The lignin content in both the induced leaves and un-induced leaves increased after treated with chemical elicitors.(2) The lignin synthesis in treated tomato leaves were further promoted by exterior Ca2+, but inhibited by Ca2+chelator EGTA and the plasmalemma Ca2+channel blocker La3 +in different levels. These results indicated that Ca2+play a positive regulation role in synthesis of lignin in tomato leaves induced by the above four chemical elicitors.

Keywords: tomato; calcium; chemical elicitor; lignin

木质素是植物细胞壁的重要组成成分，植物体木质素含量与的其抗病性密切相关[1-2]。通常植物组织中木质素含量越高，其抗病性也越强；反之，其抗病性则较弱[3]。水杨酸(SA)、 茉莉酸甲酯(MeJA)、 β-氨基丁酸(BABA)和龙胆酸(GA)可诱导多种植物增强抗病性[4-7]，而SA及其类似物和茉莉酸类等物质诱导的植物抗病性，与其促进植物体内木质素含量的提高有关[8-10]。

钙作为作为植物最重要的胞内第二信使之一[11-12]，参与多种诱抗剂诱导植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫的调控。例如，外源Ca2+显著促进SA诱导葡萄和H2O2诱导玉米幼苗耐热性的增强，而Ca2+螯合剂(如EGTA)、 Ca2+通道抑制剂(如钌红、 LaCl3)及CaM颉抗剂等，则显著抑制上述诱抗剂诱导葡萄和玉米幼苗的耐热程度[13-14]。另有研究表明，Ca2+也参与茉莉酸(JA)和a-吡啶羧酸(PA)诱导拟南芥防卫反应的调控[15-16]。余朝阁等研究证明，Ca2+可显著增强SA和MeJA诱导番茄对灰霉病的抗性，而EGTA和LaCl3则显著抑制SA和MeJA诱导的番茄抗灰霉病程度[17-18]。

那么，SA、 MeJA、 BABA和GA是否诱导番茄木质素含量的增加？钙对上述化学诱抗剂诱导番茄木质素的含量是否具有调控作用？其调控特点如何呢？本研究针对上述问题，通过外源施钙和缺钙处理，探索了钙对SA、 MeJA、 BABA和GA诱导番茄木质素含量的调控作用及特点，以期为植物诱导抗病性的调控机制研究奠定基础，为蔬菜病害可持续治理提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

番茄品种为L402；育苗穴盘规格为长×宽×高=54 cm×28 cm×4.5 cm，每盘50孔；定植钵规格为： 直径×高=12cm×12cm的塑料钵；育苗和定植所用基质均为沈阳农业大大学蔬菜无土育苗营养基质(专利号： ZL03133591.8)；试化学试剂SA、 CaCl2、 LaCl3和EGTA购自国药集团化学试剂有限公司，MeJA、 GA和BABA购自Sigma公司。

1.2 材料培养与处理

番茄穴盘育苗，3叶期定植于塑料钵中，每钵装基质保持压实后10 cm高度。6叶期分别用3 mmol/L的SA、 MeJA、 GA 和9.0 mmol/L的BABA(均含0.1%的Tween 20)均匀涂抹番茄第3片真叶(由基部向顶端计算，以下同)至完全润湿(诱导处理)，对照涂抹0.1%的Tween20；晾干后(约1.5 h)各处理分别喷施CaCl2(20 mmol/L)、 蒸馏水、 EGTA(5 mmol/L)和LaCl3(3 mmol/L)，对照喷雾等量蒸馏水，各处理组合见表1。处理后0、 1、 2、 3、 5 d分别取番茄第3叶片(诱导叶)和第5叶片(非诱导叶)，液氮速冻后保存于-86℃下，用于测定木质素含量。每处理3株，设3次重复。

表1 番茄处理组合

1.3 木质素含量测定

测定参照Morrison 方法[19]略作改动。准确称取1.0 g样品，于95%乙醇中研磨成匀浆，经4500 rpm离心5 min，沉淀用95%乙醇洗3次，再用乙醇 ∶正己烷=1 ∶2(v/v)液洗2次，收集沉淀使其干燥。用2 mL 25%溴乙酰冰醋酸(溴乙酰 ∶冰醋酸=1 ∶3，v/v)溶解样品干燥物，在70℃水浴30 min，然后加入0.9 mL 2 mol/L的NaOH溶液中止反应，再加2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L羟胺盐酸，并用冰醋酸定容至5 mL。4500 rpm离心5 min，取上清液在280 nm下测定吸光值。木质素含量与OD280成正比，以每克鲜样在280 nm 处的吸光值表示木质素含量。

1.4 数据处理

数据用SPSS软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 钙对SA诱导番茄木质素含量的影响

由图1A可见，在番茄诱导叶片中，各处理第1 d起木质素含量略有升高，第2 d继续增加并显著高于对照水平，第3 d木质素含量高低顺序为SA+Ca>SA>SA+EGTA、 SA+La>CK。其中SA+Ca处理，木质素含量在第2 d迅速升高并达到高峰，然后缓慢下降；SA处理，木质素含量第2 d开始升高，第3 d达到高峰，第5 d下降；其它处理木质素含量虽有增加趋势但明显平缓。非诱导叶中各处理木质素含量变化趋势与诱导叶中类似(图1B)。表明外源Ca2+显著促进SA诱导番茄木质素合成，而EGTA和LaCl3显著抑制SA诱导番茄木质素合成。

图1 钙对SA处理番茄诱导叶(A)和非诱导叶(B)中木质素含量的影响Fig.1 Effect of calcium on lignin content in induced(A)and un-induced(B)leaves of tomato treated with SA

2.2 钙对MeJA诱导番茄木质素含量的影响

图2A显示，在诱导叶中，木质素含量分别在MeJA+Ca处理后第1 d、 MeJA处理后第2 d和MeJA+La处理后第3 d开始升高，而MeJA+ EGTA处理木质素含量与对照之间始终无显著差异；第3 d以后各处理木质素含量高低顺序为MeJA+Ca> MeJA>MeJA+La>MeJA+EGTA和CK。非诱导叶中各处理木质素含量变化趋势与诱导叶中相似，但整体升高趋势较为平缓(图2B)。说明外源Ca2+也显著促进MeJA诱导番茄木质素的合成，而EGTA和LaCl3则抑制MeJA对番茄木质素合成的诱导作用。

图2 钙对MeJA处理番茄诱导叶(A)和非诱导叶(B)中木质素含量的影响Fig.2 Effect of calcium on lignin content in induced(A)and un-induced(B)leaves of tomato treated with MeJA

2.3 钙对BABA诱导番茄木质素含量的影响

图3A显示，番茄诱导叶中各处理木质素含量第1 d即迅速升高，第2 d略有下降，第3 d除BABA+EGTA处理和对照外，其余处理又迅速升高并达到高峰，各处理木质素含量为BABA+Ca>BABA>BABA+La>BABA+EGTA>CK。而非诱导叶除BABA+EGTA处理与诱导叶中变化趋势略有不同外，其余处理木质素含量变化趋势与诱导叶中类似(图3B)。由此可见，Ca2+促进BABA诱导番茄木质素的含量，两种缺钙处理则均抑制BABA的诱导作用，且EGTA对BABA诱导番茄叶片中木质素含量的抑制作用也强于LaCl3。

图3 钙对BABA处理处理番茄诱导叶(A)和非诱导叶(B)中木质素含量的影响Fig.3 Effect of calcium on lignin content in induced(A)and un-induced(B)leaves of tomato treated with BABA

图4 钙对GA处理番茄诱导叶(A)和非诱导叶(B)中木质素含量的影响Fig.4 Effect of calcium on lignin content in induced(A)and un-induced(B)leaves of tomato treated with GA

2.4 钙对GA诱导番茄木质素含量的影响

由图4A可见，在诱导叶中，各处理木质素含量均在第1 d升高至对照水平以上，第2-3 d GA+Ca和GA处理木质素含量持续增加，GA+La处理无显著变化，GA+EGTA处理则略有下降，第3 d木质素含量高低顺序为GA+Ca>GA>GA+La>GA+EGTA>CK，第5 d各处理木质素含量均缓慢下降，其中GA+EGTA降至对照水平，其余处理仍显著高于对照水平。非诱导叶中木质素含量变化趋势与诱导叶中类似(图4B)。上述结果说明，Ca2+促进GA诱导番茄木质素的含量，两种缺钙处理均抑制GA诱导番茄木质素的含量，且EGTA的抑制作用强于LaCl3。

3 结论与讨论

SA、 MeJA、 BABA和GA是重要的植物抗病诱导剂，大量研究表明，上述化学物质可诱导植物抗病性增强[4-7]， 并有研究认为，有些诱抗剂诱导植物抗病性增强，与其诱导处理后植物体内木质素含量有关[8-10]。在本研究也发现，这四种物质均诱导到番茄木质素含量，这与前人研究结果一致。同时本研究还发现，诱抗剂处理不仅引起诱导叶中木质素含量增加，还引起其上位非诱导叶中木质素含量，推测这可能是植物诱导抗性在植株内传递的原因之一。

本研究中，外源Ca2+均促进上述四种诱抗剂诱导番茄木质素含量的增加，而钙螯合剂EGTA和质膜钙通道抑制剂LaCl3则均抑制诱抗剂的诱导作用，且EGTA对诱抗剂诱导番茄木质素含量的抑制作用大于LaCl3。前人在研究SA诱导葡萄幼苗和H2O2诱导玉米幼苗的耐热性中，Ca2+及其抑制剂也有类似的作用[13-14]；余朝阁等研究也发现，钙对SA和MeJA诱导番茄抗灰霉病及主要防御酶(PAL、 PPO和POD等)具有正调控作用[17-18]，而上述防御酶正是植物木质素合成的关键酶。所以认为，Ca2+之所以促进诱抗剂诱导番茄的抗病性，可能与其对诱抗剂诱导番茄木质素含量的正调控作用有关。但也有研究认为，钙对SA介导的植物免疫反应具有负调控作用[20]，这一点还有待进一步探索。

虽然人们对植物木质素含量与其抗病性的关系已进行大量研究，但是对钙在诱抗剂诱导植物木质素含量中的调控作用研究还鲜见报道，本文系统研究了钙对SA、 MeJA、 BABA和GA诱导番茄木质素含量的调控作用和特点，将为植物诱导抗病性的调控机制研究提供依据。

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Effectofcalciumonligninsynthesisinducedbychemicalelicitors

YU Chao-ge1, 2, HUANG Xin-yang2, LI Tian-lai1*, LIU Zhi-heng2*

(1CollegeofHorticulture,ShenyangAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofProtectedHorticultureofMinistryofEducation,Shenyang110866,China; 2CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)

2013-02-05接受日期2013-05-06

辽宁省教育厅项目(L2011115)；国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD12B03)；辽宁省重大科技攻关项目(2011215003)资助。

余朝阁(1973—)， 男， 河南淮滨人， 博士， 副研究员， 从事设施蔬菜病害生理及可持续治理研究。E-mail: yuzhaoge@126.com * 通信作者 E-mail： tianlaili@126.com；lzhh1954@163.com

Q946文献识别码A

1008-505X(2013)06-1445-05