氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠模型在炎症性肠病和癌形成物质的生物测定运用

林凯璇，赵晓航

恶性肿瘤是威胁人类生命健康的主要原因，每年因此死亡人数达760万[1]。由于机体、疾病和社会之间错综的复杂性，科研工作者在攻克疾病过程中困难重重。例如，慢性炎症发展为癌症是一个多基因参与、多步骤完成的复杂过程。在伦理道德允许条件下，获取人体组织样本尤其是癌前病变组织样本非常困难。因此，借助动物模型成为科学研究的重要手段。本文针对炎症性肠病(inflammatory disease，IBD)致直结肠癌(colorectal cancer，CRC)动物模型——氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)模型及其在生物测定运用作一综述。

1 炎症性肠病和癌形成

CRC是全球常见致死性恶性肿瘤之一，发病率分居男性第二、女性第三[1]。CRC是IBD最严重的并发症。所谓IBD是一类病因和发病机制尚未完全明确的肠道炎性疾病，它是遗传和环境因素相互作用的综合结果，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)两种病理类型。IBD临床表现为不断复发、缓解的复杂病程，病理表现为周期性肠黏膜坏死和再生。这个重复损伤与修复的过程增加了黏膜上皮恶变的风险，促进癌形成的作用，对患者身体机能、生活质量和医疗负担都有明显的消极影响[2]。虽然IBD相关癌变仅占全部CRC的1%～2%[3]，但流行病学显示IBD呈逐年上升和年轻化趋势[4]，发病8～10后以每年0.5%～1%风险率递增，30年后风险率可达18%。因此，通过防治IBD预防CRC形成是减少CRC发病率的有效手段之一。

2 AOM/DSS模型和特性

AOM/DSS模型是目前使用最广泛的CRC化学诱导模型[1]，它在致癌剂AOM诱发突变损伤基础上，使实验鼠持续暴露在致炎剂DSS环境下发展而来[5]。因此，AOM/DSS模型实际上展示的是一种IBD导致CRC的过程。

AOM 是致癌剂 1，2-二甲基肼(1，2-dimethylhydrazine，DMH)中间代谢产物，其引起的鸟嘌呤O6甲基化是诱导突变损伤最重要原因。由AOM引起的癌形成与人类CRC组织病理学类似，但这种建模方式需要多次AOM注射且周期长，给科研工作带来诸多不便[6]。致炎剂DSS是一种人工合成的硫酸盐多糖，它的负电荷能影响DNA合成，抑制上皮细胞增生和破坏肠黏膜屏障，导致巨噬细胞功能障碍和肠道菌群失调。利用DSS饲喂制备的炎症性肠病模型具有类似人类UC的病理改变和临床症状。多循环DSS处理也能诱导实验动物产生CRC，但制备时间长且肿瘤发生率和数量低[7]。由于炎症致癌是一个多步骤、多基因的复杂过程，持续的炎症刺激是癌症产生的关键[8-9]。1996 年，Okayasu 等[2]联合AOM(7.5 mg/kg)和3%DSS处理CBA/J小鼠成功构建了成瘤率和重复性高的CRC模型，不仅大大缩短了制备周期，而且为科研工作提供新的思路[5]。此后研究表明，AOM或DSS剂量和实验鼠品系是影响模型诱导的关键因素[10-11]。如致炎剂DSS的促癌作用具有剂量依赖性，只有DSS浓度大于1%才能促进肿瘤形成，但高剂量DSS水可引起小鼠发生严重的肠道炎症和硝基化应激反应[12]。BALB/c和C57BL/6N小鼠对AOM/DSS诱导敏感性高;C3H/HeN和DBA/2N小鼠则对AOM/DSS不敏感，处理后不发生或很少发生腺瘤[13]。因此，通过选用小鼠品系或调整AOM、DSS剂量来优化模型，以进一步提高肿瘤生成率[14-15]。

AOM/DSS模型制备分为“四步法”和“两步法”两种:“四步法”为单剂量AOM(7.5～12.5 mg/kg)腹腔注射后，即时或7 d后开始3个循环1%～3%DSS水饲喂实验鼠，每个循环4～7 d，间隔14 d;“两步法”则是单剂量AOM加单次DSS周期处理，共两步完成。与“两步法”相比，“四步法”加速了肿瘤的生长[6]。

癌前病变是正常组织向癌症发展的中间状态。IBD患者结直肠黏膜的单一不典型增生是癌前病变的表现，由IBD引起的CRC组织病理学由“正常→低度不典型增生→高度不典型增生→腺癌”顺序演变而来[7，15]。Suzuki等[15]采用 AOM(10 mg/kg)腹腔注射和单循环2%DSS饮水饲喂雄性ICR小鼠，观察炎症致癌形成不同时期病理学改变，证明经AOM/DSS处理的小鼠完全模拟了炎症相关CRC形成的组织病理学过程。除此之外，AOM/DSS模型常伴K-ras、β-catenin基因突变，有的还由错配修复基因系统缺失显示微卫星不稳定，在一定程度上也模拟了人类CRC基因水平上的变化[5]。

3 AOM/DSS模型在IBD和癌形成物质的生物测定运用

由于AOM/DS模型能够高效、可重复地模拟人类IBD相关CRC特性，越来越多的科研人员利用它来进行IBD致癌的机制研究、药物毒性或治疗效果评估等。之前综述了AOM/DSS模型在炎症相关癌变机制的研究[16]，在此主要总结部分运用 AOM/DSS模型探索防治或促进肠炎致结肠癌相关物质的生物测定研究(表1)。生物测定(bioassay)是利用生物来检测物质作用的方法[17]。IBD导致CRC过程中，人们无法得知毒物或药物对整个疾病发展过程是否产生影响或产生何种影响以及其中的作用机制是什么，因此科研人员借助AOM/DSS模型这一平台，可能能够回答上述问题。

IBD的病理机制与炎症介质升高有关，包括活性氧族(reactive oxygen species，ROS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible oxide synthase，iNOS)、前列腺素类(prostaglandins，PGs)和细胞因子[如肿瘤坏死因子-α(tumor nerosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)]等[21]。转录因子如核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和转录激活因子-3(signal transducers and activators of transcription-3，STAT-3)异常激活导致细胞存活、不受限制增生[31-32]。研究表明，IBD通过NF-κB信号通路导致CRC发生，启动NF-κB－IL-6－STAT-3级联反应促进肿瘤细胞增生[33-34]。对比表中不难发现，多数天然有机物、维生素类和非甾体抗炎药类防治炎症致癌的物质，主要通过减少炎症介质[如IL-6、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、NO、前列腺素 E(prostaglandin E，PGE)等]释放，降低 β-连环蛋白，减少氧化应激反应，诱导细胞凋亡启动子半胱天冬酶(Caspase)等机制来抑制AOM/DSS模型炎症刺激和CRC形成。

山药主要成分薯蓣皂苷配基具有抗高血糖、高胆固醇、高三酰甘油和抗癌作用，其既不能在哺乳动物中合成也不能被代谢为类固醇，对人体安全。Miyoshi等[18]实验表明，山药粉/薯蓣皂苷配基能够通过降低炎性因子和增加脂蛋白酯酶从而降低三酰甘油类表达和改善脂类代谢;增加血红素加氧酶、过氧化物歧化酶-3、Casepase-6的表达增强抗氧化应激反应能力和诱导凋亡。葡萄内酯主要存在芸香和伞形科植物中，属于次级代谢物，能抗炎，减少iNOS、COX-2、氮负离子和PGE2等产生，还可以抑制TNF-α释放和抑制性蛋白κB降解。葡萄内酯能抑制AOM/DSS引起的结肠炎相关性结肠癌形成，且没有任何副作用[19]。川陈皮素通过使促分裂原活化蛋白/细胞外信号调节蛋白激酶的失活来降低瘦素分泌，从而降低AOM/DSS腺瘤和腺癌的发生[20]。苯乙基异硫氰酸盐(phenethyl-isothiocyanate，PEITC)是十字花科蔬菜中葡糖异硫氰酸盐的代谢物，能够诱导肿瘤细胞周期障碍和凋亡;二苯甲酰甲烷(dibenzoylmethane，DBM)是姜黄素 β-二酮基结构，甘草中含少量该成分，具有抗肿瘤形成特性。Cheung等[22]发现 PEITC 主要通过增加 Caspase-3、Caspase-7和p21来增加凋亡和抑制细胞周期;而DBM主要通过诱导核因子E2相关因子2和Ⅱ期去毒酶产生来防止致癌剂AOM毒性作用。5-氨基水扬酸是柳氮磺吡啶活化部分，具有抗炎、抗增殖和促凋亡作用。虽然5-氨基水扬酸能减低直结肠炎引起CRC，但化学预防作用与COX-2蛋白表达无关[30]。

流行病学显示，长期规律服用阿司匹林可以降低CRC的发生[35]。AOM/DSS模型实验证明，添加阿司匹林并不能有效减少结肠肿瘤数目和炎症程度，但是阿司匹林能影响IL-6－STAT-3通路促进肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无影响。提示阿司匹林的靶点可能是CRC细胞，适合联合其他药物加强治疗效果[26]。叶酸缺乏与散发和炎症性结肠癌有关，但AOM/DSS模型生物测定证明增加叶酸摄入对IBD及其相关CRC并没有影响。虽然高同型半胱氨酸血症与小鼠结肠肿瘤发生呈负相关，叶酸缺乏引起高同型半胱氨酸;但实验提示，模型小鼠叶酸缺乏是由于结肠炎导致吸收不良引起，而非引起肿瘤的原因[26]。

职业或环境中可能接触致癌性金属，水源污染是人们暴露于这些金属的常见途径。三价砷和六价铬属于Ⅰ类致癌剂。给AOM/DSS小鼠饲喂含砷或铬的水，发现这些金属元素致癌机制主要通过增加β-连环蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-1和促进DNA氧化损伤，同时降低抗氧化酶的表达[28]。

表1 AOM/DSS模型生物测定实验

生物测定利用生物如动植物、细胞和微生物等模型来检测某物质的作用，这种方法常被用于发展新药和检测毒性。AOM/DSS模型是目前公认的CRC化学诱导模型，由于能够很好地模拟IBD引起的CRC组织病理学全过程，成为潜在治疗药物的疗效和毒性等生物测定的常用平台。通过综合比较不难发现，对防治CRC有效的保护性药物大多具有抗炎、抗氧化、抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的功效，机制与炎性因子、炎症相关信号通路息息相关。致癌性物质则通过促进DNA损伤、增加氧化诱导癌发生。除生物测定外，利用AOM/DSS模型进行的研究还涉及炎症致癌信号通路、肿瘤微环境等。由于该模型小鼠寿命短，且少有结肠腺瘤性息肉病基因和p53基因突变，CRC发生远处转移倾向低，因此不适合研究肿瘤侵袭相关研究[5]。随着AOM/DSS模型和基因突变等方法结合，使该模型发展不断完善，为进一步探讨和解决科学问题提供更好平台。

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