大孔树脂法分离纯化阿维菌素工艺研究

逯凯霄，王栋良，李学红，刘书琴

（华北制药集团爱诺有限公司，河北 石家庄052165）

阿维菌素（Avermectin）是由灰黄链霉菌发酵产生的带双糖支链的十六元大环内酯类抗生素[1］，由一组结构相近的 A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b等8个同系物组成，其中阿维菌素B1a的生物活性最高，含量大于90%[2］。

阿维菌素首先由日本北里大学和美国Merck公司开发为具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的杀虫剂[3］，由于其作用机制独特，对害虫具有触杀和胃毒作用[4］，对人畜安全，具有高选择性和高安全性，是当前生物农药市场中最受欢迎和具有竞争性的新产品，同时也是农业部推荐的高毒农药的首选替代品种之一。

目前，我国阿维菌素制剂的年产量已达万吨，是微生物农药中年产值最大的品种[5］。但目前采用的分离方法一般为溶媒提取结晶法[6］，溶剂用量及损耗量大，生产成本高，成为阿维菌素类产品持续发展的瓶颈。作者首次采用大孔树脂对阿维菌素进行分离纯化，结果令人满意。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

阿维菌素发酵液、双蒸水，自制；阿维菌素标准品，美国Sigma公司；大孔树脂D312、HZ816、HZ801，上海华震科技有限公司；大孔树脂 D101、LX－11、AB－8，西安蓝晓科技有限公司；大孔树脂 Amberlite XAD1600，美国罗门哈斯公司；乙腈（色谱纯），美国Merck公司；工业乙醇，沧州兴隆化工有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

高效液相色谱仪（996检测器，515泵），Waters公司；Loborata 4000型旋转蒸发器，Heidolph公司；TGL－16G型高速离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈－水 （90︰10，体积比）；流速：1.0mL·min－1；检测波长：210nm；进样量：10μL。阿维菌素保留时间为9.5min。

精密称取阿维菌素标准品5mg置于50mL容量瓶中，用流动相溶解；再精密移取该溶液5mL置于50 mL容量瓶中，用流动相定容，摇匀，得标准品溶液。取标准品溶液10μL注入色谱仪，采用外标法按上述色谱条件测定。该方法在阿维菌素浓度为0.25～25 μg· mL－1范围内有良好线性关系（R＝0.9999）；加标回收率（n＝5）为100.8%，RSD为0.89%。

1.3 方法

1.3.1 发酵液预处理及阿维菌素的提取

阿维菌素主要存在于菌丝体内，为了提高固液分离时的过滤速度，在发酵液中按3∶100（g∶mL）加入珍珠岩，搅拌30min后真空抽滤，水顶洗，得阿维菌素菌丝体。

向阿维菌素菌丝体中按2∶1（mL∶g）加入95%乙醇后搅拌浸提1h，过滤，得1次浸提液；向浸提后的菌丝体中再按2∶1（mL∶g）加入95%乙醇，搅拌浸提1h，过滤，得2次浸提液；合并浸提液，浸提收率为95.21%（n＝3）；50℃下减压浓缩浸提液至乙醇浓度为50%，待上大孔树脂柱。

1.3.2 树脂吸附和解吸

1.3.2.1 树脂的预处理及再生

树脂预处理方法：用95%乙醇充分浸泡树脂1～2次，除去致孔剂，用水反复洗涤至洗涤液无乙醇气味；用2mol·L－1盐酸浸泡树脂4h，水洗至中性；再用2 mol·L－1氢氧化钠溶液搅拌浸泡4h，水洗至中性后，用50%乙醇平衡，备用。

树脂再生方法与预处理基本相同。

1.3.2.2 树脂的筛选

根据阿维菌素的脂溶特性，选用非极性树脂D312、HZ816、D101、LX－11、XAD1600及中等极性树脂HZ801、AB－8共7种型号大孔树脂作为吸附载体，进行动态吸附筛选。分别取预处理好的上述树脂各100mL，重力沉降法装柱，上端加入浓缩后的阿维菌素浸提液，流速为200mL·h－1，HPLC在线检测，当流出液中阿维菌素含量为上样液含量的10%时，树脂吸附饱和，停止上样，计算吸附容量。

1.3.2.3 吸附流速的选择

将等体积浓缩后的阿维菌素浸提液分别以50mL·h－1、100mL·h－1、150mL·h－1、200mL·h－1、250mL·h－1、300mL·h－1的流速通过 HZ816树脂柱吸附，HPLC检测流出液中阿维菌素含量。

1.3.2.4 洗脱溶剂的选择

选用等体积甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇等4种溶剂，对饱和HZ816树脂进行解吸，HPLC检测解吸液中阿维菌素的含量，考察洗脱溶剂对解吸收率的影响。

1.3.2.5 洗脱溶剂体积分数的选择

取100mL饱和HZ816树脂用50%乙醇洗涤后，再用不同体积分数的洗脱溶剂进行洗脱，洗脱速度50 mL·h－1，HPLC在线检测，考察洗脱溶剂体积分数对B1a含量、解吸收率的影响。

1.3.3 结晶

合并洗脱液中B1a含量大于90%部分，减压浓缩至无乙醇流出后，加入95%乙醇至结晶液中，阿维菌素浓度为10mg·mL－1，45℃下加热溶解，5℃下放置8h，过滤，再于5℃下用乙醇洗涤滤饼，真空干燥，得到白色阿维菌素粉末。

2 结果与讨论

2.1 树脂筛选结果

考察了7种大孔树脂对阿维菌素的动态吸附量，结果见图1。

图1 不同型号大孔树脂动态吸附量的比较Fig.1 Comparison of dynamic adsorption capacity for different macroporous resins

由图1可以看出，大孔树脂HZ816具有最佳吸附性能，动态吸附量达到62mg·mL－1。因此，选择大孔树脂HZ816作为阿维菌素的吸附载体。

2.2 吸附流速的选择

不同吸附流速下HZ816树脂的阿维菌素吸附率见图2。

图2 上样液吸附流速对HZ816树脂吸附性能的影响Fig.2 Effect of flow rate of sample solution on adsorption performance of resin HZ816

由图2可以看出，吸附流速越慢，HZ816树脂的阿维菌素吸附率越高；但吸附流速过慢会延长产品的生产周期，提高生产成本。综合考虑，选择150～200 mL·h－1（1.5～2BV·h－1）作为吸附流速。

2.3 洗脱溶剂的选择

采用4种不同洗脱溶剂，HZ816树脂的解吸收率见图3。

由图3可以看出，乙醇具有较好的解吸能力。因此选择乙醇作为洗脱溶剂。

2.4 乙醇体积分数的选择

用不同体积分数乙醇洗脱时，阿维菌素解吸收率和B1a含量见表1 。

图3 不同洗脱溶剂的HZ816树脂解吸收率Fig.3 The desorption yield of resin HZ816with different eluents

表1 不同体积分数乙醇洗脱对阿维菌素解吸收率和B1a含量的影响Tab.1 Effect of different volume fractions of ethanol on yield and B1acontent of avermectin

由表1 可以看出，乙醇体积分数大于90%时，解吸收率较高，但由于阿维菌素洗脱过快，色谱峰与杂质峰不能有效分离；当乙醇体积分数小于90%时，虽然B1a含量较高，但解吸拖尾现象严重，洗脱体积明显增加。因此，选择90%乙醇为洗脱剂，阿维菌素分离效果好，洗脱速度快。

2.5 验证实验

选择大孔树脂HZ816作为吸附载体，在吸附流速为1.5～2BV·h－1、90%乙醇作为洗脱剂的条件下进行3次验证实验。结果表明，平均解吸收率大于90%、阿维菌素中B1a含量大于91%、总收率大于65%。表明大孔树脂有效地摒弃了浸提液中的色素和大极性杂质，提高了解吸液的质量，而且具有较高的吸附率和解吸率，为下游结晶工序打下基础。

3 结论

研究了大孔树脂法分离纯化阿维菌素的方法。选择大孔树脂HZ816作为吸附树脂，在吸附流速为1.5～2BV·h－1、90%乙醇作为洗脱剂的优化条件下，解吸收率大于90%、阿维菌素中B1a含量大于91%、总收率大于65%。该方法工艺简单、分离效果好，可用于工业化生产。

[1]Burg R W，Miller B M，Baker E E，et al.Avermectins，a new family of potent anthelmintic agents：Producing organism and fermentation[J］.Antimicrob Angents Chemother，1979，15（3）：361－367.

[2]Pozo O J，Marin J M，Sancho J V，et al.Determination of abamectin and azadirachtin residues in orange samples by liquid chromatography－electrospray tandem mass spectrometry[J］.Journal of Chromatography A，2003，992（1－2）：133－140.

[3]Lasota J A，Dybas R A.Avermectins，a novel class of compounds：Implications for use in arthropod pest control[J］.Annu Rev Entomol，1991，36：91－117.

[4]吕淑君.阿维菌素的生物合成[J］.国外医药抗生素分册，1997，18（2）：114－118.

[5]朱昌雄，孙东园，蒋细良.我国微生物农药产业化标准及产业化对策建议[J］.现代化工，2004，24（3）：6－11.

[6]宋渊.阿维菌素的工业化生产研究[J］.精细与专用化学品，2002，10（21）：57－59.