4－羟基环孢菌素A衍生物[γHyMeLeu4］CyA生产菌的接合转移

刘 静，戴 梦，章 丽，赵 颖，郑桂珍，张 佳，王富强

（华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄050015）

环孢菌素 A[1］（Cyclosporin A，CyA）作为高效免疫抑制剂广泛应用于器官移植，不同生物活性的CyA衍生物，具有抗真菌、抗炎、抗寄生虫、抗 HIV等功能[2］。

作者前期分离得到一株稀有放线菌CYA4OH，经16SrDNA鉴定，属于野野村菌（Nonomuraeasp.），该菌可以在CyA底物的4－位引入羟基，得到4－羟基CyA 衍生物[γHyMeLeu4］CyA。[γHyMeLeu4］CyA自身缺乏免疫抑制活性[3］，但具有潜在的抗真菌活性，还可以作为中间体进一步合成多种具有活性的药物。

pZMW质粒[4］含有PermE启动子和病毒φC31的整合位点（attP），可以通过接合转移将外源基因转入到糖多孢红霉菌染色体中。野野村菌与糖多孢红霉菌同属放线菌类，作者在此构建了以硫链丝菌素抗性基因tsr为报告基因的表达载体pZMW－tsr，将其转入大肠杆菌（Escherichia coli）ET12567（pUZ8002），采用接合转移法将tsr基因转入 [γHyMeLeu4］CyA 生 产 菌CYA4OH，尝试在CYA4OH菌中表达外源基因，为其转化机制及基因工程改造研究提供参考。

1 实验

1.1 菌种、质粒与培养基

本研究所用菌种均为自行保存。CYA4OH为[γHyMeLeu4］CyA生产菌，大肠杆菌DH5α为常规克隆和分子操作的宿主菌，大肠杆菌ET12567（pUZ8002）为接合转移供体菌。

克隆载体pGEM－T购自Promega公司；表达载体pZM[5］、pZMW[4］为张部昌博士惠赠。

MS培养基：甘露醇2%，黄豆饼粉2%，琼脂1.5%。

ISP2斜面培养基：酵母提取物0.4%，麦芽提取物1%，葡萄糖0.4%，琼脂1.5%，pH 值7.3。

种子培养基：淀粉1.0%，葡萄糖0.7%，麦芽粉0.5%，酵母提取物0.45%，蛋白胨0.5%，碳酸钙0.005%，pH 值7.0。

2×YT培养基：胰蛋白胨1.6%，酵母抽提物1%，NaCl 0.5%，pH 值7.0。

1.2 主要试剂与仪器

PCR试剂、DNA Marker、胶回收试剂盒、连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver 2.0，Takara公司；琼脂糖、限制性内切酶，Promega公司；各种抗生素，Sigma公司；Easy－DNA试剂盒，Invitrogen公司；其它试剂均为国产分析纯。引物由生工生物工程股份有限公司（Sangon）合成。

C24KC型摇床，New Brunswich Scientific公司；Allegra 64R 型离心机，Beckman公司；ABI9600型PCR仪，PE公司；电泳仪，北京六一仪器厂；LAS3000型成像仪，FUJIFILM公司。

1.3 pZMW－tsr表达载体的构建

硫链丝菌素抗性基因tsr的扩增引物tsr1：5′－ccCATATGactgagttggacacc－3′，tsr2：5′－ccTTAATTAAatcggttggccgc－3′。分别在基因上游引入NdeⅠ位点，下游引入PacⅠ位点。

从载体pZM中扩增得到tsr基因片段，25μL反应体系中含10×LA－Taq酶缓冲溶液2.5μL、2.5 mmol·L－1dNTP 2μL、10μmol·L－1引 物 各0.5μL、LA－Taq酶0.2μL、模板质粒30ng。扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，循环30次；最后72℃延伸10min。tsr片段经纯化后克隆至pGEM－T载体中。使用内切酶NdeⅠ与PacⅠ将tsr片段切下，同时用这两种酶处理载体pZMW；连接构建pZMW－tsr表达载体。将pZMW－tsr转入大肠杆菌ET12567（pUZ8002）。

1.4 [γHyMeLeu4］CyA生产菌CYA4OH 的接合转移

单孢子悬液制备：菌种培养使用MS培养基，加水从斜面上洗下孢子。将斜面孢子打散、过滤、分装，用2×YT培养基洗涤1次，重悬于500μL 2×YT培养基中，50℃热激15min。每次反应孢子用量约2×108个。

接合转移：将大肠杆菌 ET12567（pUZ8002，pZMW－tsr）在LB培养基（卡那霉素25μg·mL－1，氯霉素25μg·mL－1，安普霉素25μg·mL－1）中37℃培养到对数生长期。取50mL菌液离心浓缩，用LB培养基洗涤2次，重悬于5mL LB培养基中。取500 μL悬液至单孢子悬液中，混匀，涂布于MS固体培养基上，30℃培养18h后，加盖安普霉素（25μg·mL－1）、硫链丝菌素（25μg·mL－1）和萘啶酮酸（25 μg·mL－1），30℃培养13d后检测生长的单菌落。

1.5 转基因菌株的培养

将CYA4OH转基因单菌落接种于ISP2斜面培养基，待长出丰满孢子后接种于种子培养基中，30℃培养44～48h。

1.6 转基因菌株的PCR鉴定

收集菌丝，用生理盐水洗2遍，取适量菌体液氮研磨。研磨好的菌体粉末按Easy－DNA试剂盒说明书提取基因组DNA。以CYA4OH基因组为模板，扩增体系及反应条件同步骤1.3，同时以载体pZM作阳性对照。

2 结果与讨论

2.1 pZMW质粒在CYA4OH宿主菌中表达tsr

为了检验pZMW是否能够通过接合转移在CYA4OH中表达外源基因，选择较易观察转化结果的tsr抗性基因作报告基因。用PCR方法从pZM质粒上扩增tsr抗性基因的编码序列，并克隆于pZMW质粒的NdeⅠ和PacⅠ位点，构建了质粒pZMW－tsr。将pZMW－tsr转入大肠杆菌 ET12567（pUZ8002），再通过接合转移的方法将其转入CYA4OH菌。结果表明，转化菌能够在含安普霉素与硫链丝菌素的培养基上生长，表明pZMW已经转入宿主菌CYA4OH中，且PermE启动子能在菌中表达外源基因tsr。

2.2 鉴定表达质粒在CYA4OH染色体上的整合

将2株CYA4OH转化菌接入含25μg·mL－1硫链丝菌素的种子培养基，30℃培养48h后，提取基因组DNA。以提取的DNA为模板，用tsr抗性基因编码序列引物tsr1、tsr2进行PCR扩增。结果表明，PCR产物大小与tsr编码基因大小完全一致（图1），表明质粒pZMW在CYA4OH菌中是整合到染色体上的。

图1 转化菌CYA4OH（pZMW－tsr）的PCR鉴定Fig.1 PCR Identification of CYA4OH（pZMW－tsr）

2.3 讨论

野野村菌将CyA底物羟基化早有报道；CyA衍生物的传统化学合成法转化效率不高，产物不特异；采用微生物转化的方式可以高效地将CyA底物转化为其4－羟基衍生物，且转化过程更加环保[3，6］。

为了研究CyA衍生物生产菌CYA4OH的转化机制并对其进行基因工程改造，有必要建立其DNA转移系统。建立宿主自身的基因转移系统是基因鉴定、分析和其它遗传操作的前提。接合转移与通常使用的原生质体转化方法相比，是一种操作简单又高效的方法。本研究成功地将pZMW通过接合转移转入到稀有放线菌野野村菌CYA4OH中，并验证了外源基因在菌体中的表达，为建立其遗传操作体系进行了有意义的探索。

3 结论

将染色体整合型糖多孢红霉菌表达载体pZMW－tsr转入大肠杆菌ET12567（pUZ8002），以其作为供体，采用接合转移的方法将硫链丝菌素抗性基因tsr转入4－羟基环孢菌素A衍生物[γHyMeLeu4］CyA生产菌野野村菌CYA4OH中。PCR结果表明，基因已经整合到CYA4OH基因组上。研究表明pZMW载体能够在稀有放线菌野野村菌中有效表达外源基因。

[1]Kahan B D.Cyclosporin A：A new advance in transplantation[J］.Tex Heart Inst J，1982，9（3）：253－266.

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[3]Park N S，Myeong J S，Park H J，et al.Characterization and culture optimization of regiospecific cyclosporin hydroxylation in rare actinomycetes species[J］.J Microbiol Biotechnol，2005，15（1）：188－191.

[4]张部昌，李凌凌，于秀琴，等.糖多孢红霉素表达载体pZMW的构建[J］.军事医学科学院院刊，2003，27（3）：176－179.

[5]张部昌，刘祚军，曹孟婵，等.糖多孢红霉菌多拷贝表达载体pZM的构建[J］.中国生物工程杂志，2004，24（5）：43－46.

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