流加补氨水代替碳酸钙在井冈霉素生物发酵中的研究

刘义雄，张文宣，周圣骄，谷 田，钟名兴

（江西新瑞丰生化有限公司，江西 新干331307）

井冈霉素是我国农用抗生素中产量和用量最大的品种，多用于防治水稻纹枯病、稻曲病和蔬菜苗期立枯病、白绢病等，是一种无公害无残留的环保型农药[1－4］。

井冈霉素是吸水链霉菌井冈变种发酵过程中的代谢物，有A、B、C、D、E、F 6个组分，其中组分A的药效最好[5］。井冈霉素的工业生产采用深层、通气搅拌二级或三级发酵法，目前其发酵培养基配方中加有碳酸钙，用于调控pH值以保证菌体正常生长代谢和产素分泌[6］。井冈霉素产品主要分为水剂和粉剂两种，水剂的生产工艺为发酵液经预处理、过滤、薄膜浓缩、蒸发等而得，粉剂的生产工艺大多也仅仅是将水剂再进行浓缩，然后真空烘干[7］。薄膜浓缩过程不仅能耗高，而且长时间的高温处理对产品有效组分破坏大，使得收率偏低，且产品中杂质较多后加工困难。尤其是发酵培养基中加入碳酸钙后，料液中含有较多的钙离子，导致提炼过程中钙盐结垢容易堵塞薄膜浓缩器列管，需要经常清洗列管，使得列管使用寿命缩短、工作效率降低、提炼成本增加，同时在采用低能耗的膜分离浓缩提取工艺时，也易导致膜孔堵塞，限制了低能耗膜分离浓缩工艺的应用。

已有研究采用流加补氨水的方法来代替传统的碳酸钙调节pH值用于赤霉素GA4＋7生物发酵及后提取，膜分离浓缩效果较好[8］，也有文献报道其它品种的通氨工艺研究[9，10］，但均未涉及到流加补氨工艺对后续提取工艺、产品质量的影响。井冈霉素发酵生产周期较短，此前未见其中间补氨工艺的相关报道。

作者利用5m3中试罐进行了井冈霉素发酵多批次流加补氨水代替碳酸钙调控pH值的试验，并在20 m3的生产罐上进行了穿插对比试验，以确定流加补氨水的工艺条件及其对井冈霉素发酵、后提取生产水平和产品质量的影响，拟为降低生产成本、推广应用于工业化生产提供技术支撑。

1 实验

1.1 菌株与培养基

吸水链霉菌井冈变种（Streptomyces hygroscopicus var.jingganus）NRF－0601，江西新瑞丰生化有限公司。

种子培养基（g·L－1）：玉米淀粉36，大米粉10，花生粉25，酵母粉5，磷酸二氢钾0.1，氯化钠2.0，泡敌0.3。

发酵培养基（g·L－1）：大米粉100，黄豆粉20，酵母粉10，磷酸二氢钾1.0，氯化钠1.6，碳酸钙3.0，泡敌0.2；中途流加工业浓氨水（浓度＞25%，用量按流加pH值控制）。

1.2 设备

700L不锈钢种子罐；4m3不锈钢种子罐；5m3不锈钢发酵罐；20m3发酵罐。

1.3 方法

1.3.1 试验工艺流程

（1）斜面孢子→种子培养液 （350L／700L罐）→发酵液（4m3／5m3罐）→提炼。

（2）斜面孢子→种子培养液（2.8m3／4m3罐）→发酵液（18m3／20m3罐）→提炼。

1.3.2 氨水的中途流加

发酵液pH值降至6.2时开始流加补氨水，全程控制pH值6.0～6.4。

1.3.3 检测方法

（1）pH 值采用465－50－SC－P－S7／150／9848型pH测定仪（梅特勒·托利多）在线检测。

（2）氨基氮浓度测定采用甲醛法。

（3）总糖含量测定采用裴林试剂法。

（4）固含量测定采用离心沉淀法。试样于3000r·min－1离心沉淀10min。固含量按下式计算：

（5）井冈霉素A效价测定采用HPLC法。

检测条件：色谱柱为200mm×4.6mm（id）不锈钢柱，内装ODS－C18填充物，5μm；流动相为甲醇－磷酸氢二钠水溶液（30∶1000），流速1.0mL·min－1；柱温为室温；检测波长210nm；进样体积20μL。

流动相配制：称取0.71g无水磷酸氢二钠溶于1000mL二次重蒸水中，用磷酸调节pH值为7.0，加入30mL甲醇，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤并脱气，备用。

试样中井冈霉素A的含量（Xs）按下式计算：

式中：As为试样峰面积；Xc为标样含量；c为标样浓度；n为试样稀释倍数；Ac为标样峰面积。

2 结果与讨论

2.1 5m3罐发酵试验结果

2.1.1 工艺参数分析

在5m3发酵罐中，进行了流加补氨水调pH值（试验罐）与加碳酸钙调pH值（对照罐）的发酵对比试验，共进行4次试验，结果取平均值，绘制代谢曲线，见图1。

图1 发酵过程中的pH值（a）、氨基氮浓度（b）、总糖含量（c）、固含量（d）变化曲线Fig.1 Change curves of pH value（a），amino nitrogen concentration（b），total sugar content（c），solid content（d）in fermentation process

从图1可知，流加补氨水试验罐的pH值曲线比对照罐更平稳，试验罐pH值均控制在6.1～6.4的受控范围内，而对照罐pH值控制曲线波动明显较大；与对照罐相比，试验罐氨基氮浓度较高，但总糖含量和固含量的波动很接近，说明流加补氨水能保证碳源的正常利用与菌体的正常生长，对井冈霉素菌体生长无明显不良影响。

2.1.2 井冈霉素A发酵效价

5m3试验罐与对照罐的井冈毒素A发酵效价比 较见表1 。

表1 5m3罐流加补氨水与对照的井冈霉素A发酵效价比较／μg·mL－1Tab.1 Comparison of Jinggangmycin fermentation titers for fed－batch ammonium feeding and the contrast in 5m3 tank／μg·mL－1

从表1 可知，流加补氨水代替碳酸钙调控pH值对井冈霉素发酵效价无不利影响，甚至有一定的促进作用，平均提高发酵效价3.6%，可在生产大罐上进一步验证。

2.2 20m3罐发酵试验的井冈霉素A发酵效价

采用5m3罐流加补氨水井冈霉素发酵试验工艺，在20m3罐内进行了井冈霉素发酵生产大罐的穿插对比试验，试验罐与对照罐交替进罐各10批，结果见表2 。

从表2 可知，流加补氨水代替碳酸钙调控pH值对井冈霉素发酵效价无不良影响。

2.3 流加补氨水发酵对井冈霉素提取收率的影响

将流加补氨水代替碳酸钙调控发酵pH值的井冈霉素生产大罐在后提取中采用膜分离浓缩工艺的试验罐批与采用传统薄膜浓缩工艺的对照罐批进行井冈霉素A提取收率的对比，结果见表3 。

表2 20m3罐流加补氨水与对照的井冈霉素A发酵效价比较Tab.2 Comparison of Jinggangmycin fermentation titers for fed－batch ammonium feeding and the contrast in 20m3tank

表3 膜分离浓缩工艺和传统薄膜浓缩工艺井冈霉素A提取收率的比较Tab.3 Comparison of Jinggangmycin extraction yield for membrane separation and concentration process and traditional thin－membrane concentration process

从表3 可知，试验罐批比对照罐批的浓缩收率提高了6.8%，水剂总收率提高了6.2%，证明流加补氨水代替碳酸钙调控发酵pH值的井冈霉素发酵料液后提取采用膜分离浓缩工艺的效果更好。

2.4 讨论

由于钙离子容易造成列管结垢，采用传统的薄膜浓缩工艺时井冈霉素料液在浓缩过程中温度较高、耗时长，不仅耗汽量大，而且对产品浓缩收率有很大的影响，提取成本较高。膜分离浓缩是在常温下工作，对产品的有效成分没有破坏作用，具有浓缩效率高、成本低等优点[11，12］。流加补氨水井冈霉素发酵避免了碳酸钙的影响，使膜分离浓缩工艺代替薄膜浓缩工艺可行，对提高井冈霉素提取收率、降低成本有利。

为了制备井冈霉素高含量粉剂（原药）产品，必须首先得到无沉淀物且低盐的井冈霉素高浓度水剂（20%以上），然后以该高浓度水剂产品为基础，通过树脂吸附、纳滤除盐、刮板浓缩、喷雾干燥等工序，最终得到井冈霉素高含量粉剂（原药）产品。但由于薄膜浓缩只能蒸发水分，往往最后导致高浓度水剂中盐分超标。而膜分离浓缩具有除盐效果，能在浓缩过程中除去料液中约25%的无机盐，从而有效降低高浓度水剂产品中的盐分含量，为顺利制备井冈霉素高含量粉剂（原药）产品打下基础。

3 结论

采用流加补氨水代替碳酸钙用于井冈霉素生物发酵调控pH值的工艺，对井冈霉素菌体生长及产物分泌无不良影响；可精确调控发酵pH值，使得菌体生长及产物分泌在最适pH值环境下进行，同时，因消除了钙离子对膜分离浓缩的影响，保证了膜分离浓缩工艺的顺利实施，可显著提高井冈霉素提取收率。该工艺可以推广到大规模生产，具有非常显著的经济效益。

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