多重耐药菌中β－内酰胺酶的基因型研究＊

陈定强，彭玉婷，罗毓婷，徐韫健，林勇平，杨 羚（广州医学院第一附属医院检验科 510120）

细菌产生β－内酰胺酶是革兰阴性杆菌耐β－内酰胺类抗菌药物最普遍的机制，β－内酰胺酶相关基因赋予细菌编码对应酶的能力［1］。由于β－内酰胺类抗菌药物在临床上的广泛使用，产β－内酰胺酶的菌株也变得越来越常见，并在选择和进化压力中产生多种不同的酶基因型［2］。这些基因还往往与其他耐药相关基因（如喹诺酮类耐药基因和磺胺类耐药基因等）共同存在，导致细菌产生多重耐药性［3］。本研究收集59株临床分离的多重耐药菌，通过多重聚合酶链反应（PCR）法检测其携带的β－内酰胺酶基因类型，分析β－内酰胺酶基因在多重耐药菌中的分布特征，为进一步研究和控制细菌耐药性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 研究菌株为2009～2010年广州医学院第一附属医院临床分离的59株多重耐药菌，包括29株大肠杆菌和30株肺炎克雷伯菌。其中分离自尿液标本的32株，痰液标本19株，血液标本7株，脓液标本1株。细菌鉴定与药敏试验的质控菌株为大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923。

1.2 仪器与试剂 VITEK2全自动微生物分析仪、细菌鉴定卡与药敏卡为BioMerieux公司产品，PCR仪为Eppendorf公司产品，核酸电泳仪与凝胶成像仪为BioRad公司产品。MH培养基和药敏纸片由Oxoid公司提供。PCR扩增反应混合体系为Takara公司产品，DNA分子标记物购自Tiangen公司，琼脂糖购自Biowest公司。

1.3 细菌总DNA的提取 采用煮沸法提取细菌总DNA。挑取平板上的一个单菌落，重悬于300μL双蒸水中。置沸水浴中孵育10min后，13 500r／min离心5min，吸取上清液至新的微量离心管中，作为PCR反应的DNA模板。

1.4 PCR引物 PCR引物序列见表1，所有引物由上海英潍捷基公司合成。

1.5 β－内酰胺酶基因的检测 按照文献［4］报道的方法，用单重和多重PCR法对21种β－内酰胺酶基因进行检测。PCR反应在20μL体系中进行，包括2×PCR扩增反应混合体系10 μL，细菌总DNA模板1μL，PCR引物各1μL，并用双蒸水补至20μL。PCR反应的条件为：95℃预变性2min，然后95℃变性30s，退火温度见表1，时间为30s，72℃ 延伸1min，进行35个循环，最后延伸7min。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳40min，溴化乙锭溶液染色后用凝胶成像系统观察结果。

2 结 果

2.1 59株多重耐药菌的药敏结果 59株多重耐药菌包括29株大肠埃希菌与30株肺炎克雷伯菌，对氨苄西林的耐药率为100%，对头孢他啶的耐药率为91.5%，对庆大霉素的耐药率为66.1%，对环丙沙星的耐药率为72.9%，值得注意的是3.4%及1.7%的菌株分别对厄他培南和亚胺培南耐药，显示耐碳青霉烯类药物菌株的出现。对其他抗菌药物的耐药情况见表2。

2.2 β－内酰胺酶基因型分布 在21种β－内酰胺酶基因型中，有10种在多重耐药菌株中被检出（表3）。阳性率最高的是TEM，为54.2%（32／59）；SHV 的阳性率为45.8%（27／59）；CTX－M－G1、G2和G9的检出率分别为32.2%（19／59）、23.7%（14／59）和52.5%（31／59），说明CTX－M 型β－内酰胺酶分布非常广泛；另外，分别有4株和2株肺炎克雷伯菌检出DHA和MOX基因，CMY、OXA－1和ACT基因则各有1株检出。未检到含GES、VEB、IMP、VIM、KPC、CTX－M－G8／25、ACC、FOX、PER、OXA－48等基因的菌株。

表1 PCR引物序列和反应条件

2.3 多种β－内酰胺酶基因型共存情况分析 见表4。59株多重耐药菌中有67.8%（40／59）的菌株携带两种以上的β－内酰胺酶基因型，其中肺炎克雷伯菌携带两种以上基因型菌株更为常见，达76.7%（23／30），值得注意的是，有2株肺炎克雷伯菌携带5种β－内酰胺酶基因型。

表2 59株多重耐药菌株的药敏结果（%）

表3 59株多重耐药菌中β－内酰胺酶基因型分布情况（n）

表4 多种β－内酰胺酶基因型共存的菌株数目（n）

3 讨 论

大肠杆菌和肺炎克雷伯菌是临床感染常见的革兰阴性菌，近年来由于抗菌药物的广泛应用，多重耐药菌株的出现越来越普遍［5］。β－内酰胺类抗菌药物是临床治疗细菌感染的最常用抗菌药物，但β－内酰胺酶的产生和传播令细菌对这类抗菌药物的耐药性不断增强［6］。本研究对59株多重耐药的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的药敏试验结果分析显示，这些菌株对多种青霉素类和头孢菌素类药物的耐药性非常严重，而且出现了耐碳青霉烯类药物的菌株。有文献报道，产β－内酰胺酶的细菌往往可同时携带对其他种类抗菌药物耐药的基因，这些菌株易发展成多重耐药菌，给临床感染治疗带来很大的困难［7］。本研究中收集的59株多重耐药菌对喹诺酮类和磺胺类药物的耐药率均较高，也证实了这一点。

对21种β－内酰胺酶基因的检测结果显示，本研究收集的多重耐药菌株携带其中10种。对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的检出率分析显示，大肠杆菌仅检出4种β－内酰胺酶基因，而肺炎克雷伯菌则检出10种，由此显示后者的β－内酰胺酶基因型更具多样性。多重耐药的肺炎克雷伯菌可携带多种耐药基因，且往往是定位在可转移的质粒上，可通过在肠杆菌科细菌间的接合作用引起这些基因的扩散，进一步加大了预防控制的难度［8］。虽然研究菌株中包含了耐碳青霉烯类药物的菌株，但并未检出VIM、IMP和KPC等碳青霉烯酶，说明这些菌株中碳青霉烯类药物耐药性可能与其他因素有关，需要进一步的研究以阐明其耐药机制。

本研究还发现多重耐药菌中同时携带多种β－内酰胺酶基因的情况十分普遍。不同的β－内酰胺酶有不同的水解底物，对仅产一种β－内酰胺酶基因的菌株来说，可以选择其不能水解的β－内酰胺类抗菌药物进行治疗。但多种基因型共存于同一菌株时，细菌往往对所有青霉素类和头孢菌素类药物都耐药，大大增加了治疗的难度。如何控制和治疗这些菌株引起的感染，已经成为临床抗菌治疗和医院感染控制迫切需要解决的大问题。

［1］ Bush K.Alarming beta－lactamase－mediated resistance in multidrug－resistant Enterobacteriaceae［J］.Curr Opin Microbiol，2010，13（5）：558－564.

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［4］ Dallenne C，Da Costa A，Decre D，et al.Development of a set of multiplex PCR assays for the detection of genes encoding important beta－lactamases in Enterobacteriaceae［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65（3）：490－495.

［5］ Bonomo RA，Szabo D.Mechanisms of multidrug resistance in Acinetobacter species and Pseudomonas aeruginosa［J］.Clin Infect Dis，2006，43（Suppl 2）：49－56.

［6］ 刘云红.临床常见耐药性细菌的耐药机制［J］.中国现代医药杂志，2009，11（6）：129－130.

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