林蛙皮中透明质酸含量分析

姜大成,修伟晶,刘 丹

（长春中医药大学,长春 130117）

林蛙皮是指中国林蛙躯干表面的皮肤,作为生产哈蟆油的副产品,每年剥完哈蟆油后剩下的林蛙皮可多达数百吨,且目前林蛙皮多被弃掉或作饲料用,其营养价值没有得到充分利用。林蛙可以利用皮肤呼吸并吸收水分,其机体具有完善的保湿系统,因此具有很好的开发利用价值。笔者采用紫外可见分光光度法,分析林蛙皮中透明质酸的含量。

1 实验材料、仪器与试剂

1.1 实验材料 购买自蛙场的中国林蛙,经鉴定为蛙科动物中国林蛙（rana temporaria chensinensis）。悬挂风干,风干后剥取躯干表面一层薄皮,粉碎为0.5 cm2的粗粉。真空袋内保存,用前低温烘干。

1.2 仪器与试剂 TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、D-葡萄糖醛酸（中国药品生物制品检定所）、乙酰丙酮（天津精细化工研究所）、对-二甲氨基苯甲醛（天津精细化工研究所）、浓硫酸（北京化工厂）、咔唑（天津光复精细化工研究所）。

2 实验方法

2.1 HA粗品的提取[3]林蛙皮粗粉50 g,加入适量的蒸馏水,以完全浸没为准,4℃保存过夜,取出,研磨,回收提取液,得提取液140 mL,以 10∶1比例加入醋酸钠,搅拌使醋酸钠全溶,加入等体积氯仿:正丁醇（4∶1）溶液。吸取上层水相,量得为120 mL,加入2倍体积的无水乙醇240 mL,过夜,使之沉淀。收集沉淀,低温烘干得HA粗品,0.756 8 g。

2.2 N-乙酰氨基葡糖含量测定

2.2.1 样品溶液的制备 精密称取HA样品50 mg,加6 mol/L盐酸5 mL溶解,在沸水浴中水解2 h,取出放置室温,稀氢氧化钠调节pH至7.0,加水定容至25 mL,精密量取水解液1 mL,加入乙酰丙酮试液1 mL,置沸水中水浴15 min,取出冰水冷却至室温,再加入对-二甲氨基苯甲醛试液1 mL,加无醛乙醇至10 mL,放置30 min,待测。

2.2.2 标准曲线的制备 精密吸取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置带塞试管中,分别加水至2 mL,配制成浓度为 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL 的溶液,分别加入乙酰丙酮试液 1 mL,置沸水中水浴15 min,取出冰水冷却至室温,再加入对-二甲氨基苯甲醛试液1 mL,加无醛乙醇至10 mL,室温放置30 min,以空白管为空白,在531 nm波长处测定吸光度（见表1）,绘制标准曲线。得回归方程为Y=4.805X+0.156 5（R=0.999,n=5）,表明本品在0.02～0.10 mg/mL范围内有良好的线性关系。

2.2.3 样品测定 精密量取样品溶液0.4 mL,加水至1 mL,按标准曲线制备、显色、测定吸收度,见表1。

表1 样品中N-乙酰氨基葡糖测定

2.3 D-葡萄糖醛酸含量测定

2.3.1 样品溶液的制备 精密称取HA粗品50mg,蒸馏水溶解,定容至25 mL,取1 mL,在冰浴的条件下缓慢加入5 mL硼砂硫酸试液,在沸水浴中加热10 min,取出后冷却至室温,加0.2 mL咔唑试液,沸水浴中加热15 min,冷却至室温,待测[4]。

2.3.2 标准曲线的制备 精密吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准品储备液于试管中,加水至1mL,配制成浓度为 0.022、0.044、0.066、0.088、0.11 mg/mL 的溶液,在冰浴的条件下缓慢加入5 mL硼砂硫酸试液,沸水浴中加热10min,取出,冷却至室温,加0.2 mL咔唑试液,沸水浴中加热15 min,冷却至室温,以空白管为空白对照,在532 nm波长处测定吸收度,以D-葡萄糖醛酸钠浓度对吸光度作标准曲线,得回归方程为Y=6.591X+0.135（R=0.999 5,n=5）。可见本品在质量浓度0.022～0.11 mg/mL内呈良好的线性关系。

2.3.3 样品测定 精密量取样品溶液0.4 mL,加水至1 mL,按4.2项下制备、显色、测定吸收度,见表2。

表2 样品中D-葡萄糖醛酸含量测定

3 结果与讨论

林蛙皮50 g,提取得透明质酸粗品0.736 5 g,得率1.47%,透明质酸粗品中N-乙酰氨基葡糖含量33.143mg/g,蛙皮中N-乙酰氨基葡糖含量0.488 2 mg/g,透明质酸粗品D-葡萄糖醛酸含量为26.036 mg/g,林蛙皮中D-葡萄糖醛酸含量为0.383 5 mg/g。N-乙酰氨基葡糖含量与D-葡萄糖醛酸含量接近1∶1。

透明质酸的定量分析法有化学分析、色素结合、酶分析、电泳分析、高效液相法等,较为经济的是化学分析法,笔者采用比色法,利用透明质酸中D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺接近1∶1原理[5],采用Elson-Morgan法及咔唑法,分别测定N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸的量。Elson-Morgan法原理为,氨基葡萄糖结构中具N-甲基葡萄糖胺,在碱性溶液中与乙酰丙酮反应生成带有吡咯环的N-乙酰衍生物,再与对N-二甲氨基苯甲醛在酸性醇溶液中形成红色缩合物,该缩合物于530 nm有最大吸收;咔唑法利用分子结构中所含的己糖醛酸,在浓硫酸介质条件下与咔唑试剂反应,生成的红色物质在530 nm有最大吸收。本组采用Elson-Morgan法和咔唑法分别测定透明质酸中N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸的量,化学分析法较其他方法经济适用,且特异性和准确性高。

[1]郭学平,贺艳丽,孙茂利.透明质酸在保健食品中的应用[J].中国生化药物杂志,2000,23（l）:50-51.

[2]凌沛学,贺艳丽.透明质酸的临床研究应用进展[J].中国生化药物杂志,1998,19（4）:200.

[3]李润,倪杭生.羊眼透明质酸制备工艺的改进[J].中国医药工业杂志,1999,30（7）:289.

[4]常育,姚宏,兰英.透明质酸的制备方法[J].延安大学学报,2009,7（3）:129-130.

[5]董伟,范旭,曹光群.分光光度法测定化妆水中透明质酸含量[J].应用化工,2010,39（2）:293-294.