NGFIB-β在大鼠大脑皮层神经细胞分化中的表达研究

毕海涛 乔晓温 史为博 贾景娜 王杰 李英敏

孤儿核受体神经生长诱导基因B-β(nerve growth factor-induced gene B-β，NGFIB-β)是孤儿核受体家族中的一员［1］，因缺乏与配体相互结合的能力又称为非配体依赖性受体。NGFIB-β主要表达在中枢神经系统，与中脑的多巴胺能神经细胞的分化有密切关系［2］。敲除NGFIB-β基因的小鼠在生后24 h内很快死亡，并有黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经细胞的缺失，表明NGFIB-β是中脑多巴胺能神经细胞分化、迁移、成熟及存活重要的调控因子［3］。Zetterstrom 等［4］通过原位杂交报道了成熟小鼠及胚胎NGFIB-βmRNA在中枢神经系统的表达，但在中脑以外非典型多巴胺能神经细胞区域大脑皮层发育过程中NGFIB-β的蛋白表达状态及与神经细胞分化成熟的相关关系未见报道，本研究使用NGFIB-β小鼠单克隆抗体，采用免疫组化染色，观察了大鼠大脑皮层发育过程中NGFIB-β蛋白表达的动态变化及与细胞分化成熟的相关关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验采用Wistar大鼠，由河北医科大学实验动物中心提供，清洁级，动物合格证号：1003045，在河北医科大学实验动物中心常规标准饲养。大鼠在乙醚吸入深麻醉状态下，颈椎脱髓处死。成熟大鼠5只、孕12～19 d妊娠大鼠(每天5只)、生后1～15 d的幼鼠(选择不同孕鼠出生后的个体每天5只)，处死后立刻取出大脑皮层组织。

1.2 试剂 小鼠抗人抗大鼠NGFIB-β单克隆抗体购自英国abcam公司;免疫组化二步法试剂(LDP，labelled dextran polymer)购自北京中杉生物公司。

1.3 实验方法 组织经10%的中性甲醛溶液固定后，各级浓度的乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。免疫组化采用LDP法，首先用L-Lysine处理玻片，连续石蜡切片(4μm)，60℃烘干1 h，常规脱蜡、水化组织切片，微波抗原修复98℃，15 min(将切片置于0.01 mol/L pH值6.0的柠檬酸缓冲液中)，自然冷却至室温;切片用蒸馏水洗3 min×1，PBS洗3 min×2;3%H2O2处理10 min以抑制内源性过氧化物酶，PBS洗3 min×3;滴加NGFIB-β单克隆抗体(1∶150)，湿盒内4℃过夜;PBS洗3 min×3，滴加 LDP孵育 30 min，PBS洗 3 min×3;DAB显色 5～10 min，水洗后，苏木素复染、常规脱水、透明，中性树胶封片。

2 结果

2.1 大鼠大脑皮层发育过程中NGFIB-β表达呈显著动态变化首先在孕16 d观察到正在发育中的大脑皮层有少量阳性表达，阳性细胞主要位于大脑皮层的第Ⅴ、第Ⅵ层(图1a);孕18有阳性细胞有增多趋势(图1b);生后1～5 d的表达达到高峰且Ⅱ～Ⅵ层均可见多量阳性细胞(图1c，1d)，生后7之后随着细胞的成熟阳性细胞又逐渐减少，生后13阳性细胞明显减少，主要集中在Ⅴ～Ⅵ层(图1e);生后36(成熟)仅在Ⅴ～Ⅵ层见个别阳性细胞(图1f)。

2.2 NGFIB-β的阳性结果判定 阳性细胞为棕黄色(细胞核内表达)。用普通光学显微镜在大脑皮层随机选择5个高倍(×400倍)视野，每个视野分别计数500个细胞，最后取平均值，0：(-)＜10%：(±);＞10%：(+);＞25%：(++);＞50%：(+++)(表1)。

图1 大鼠大脑皮层发育过程中NGFIB-β的表达(免疫组化×400)

表1 NGFIB-β在大鼠大脑皮层发育过程中的表达

3 讨论

神经细胞不能进行正常分化时，会导致神经发育异常，引发多种疾病。原发性智障［5］、原发性癫痫［6］等疾病就是因为神经细胞分化迁移异常而造成的。NGFIB-β是细胞内核受体家族中的一员，Torii等［7］发现，人类 NGFIB-β基因定位于2q22-23区带上，长约8.3 kb，由8个外显子和7个内含子构成。NGFIB-β广泛表达于脑组织不同部位的神经细胞中［8］，敲除NG FIB-β基因的小鼠中脑多巴胺能神经细胞在E15.5出现了分化及分布的异常，出生后小鼠活动能力低下，生后24 h内即告死亡，免疫组化技术表明小鼠黑质和腹侧被盖区均无多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶和芳香族氨基酸脱羧酶基因表达，也无多巴胺神经递质产生，多巴胺能前体细胞不能迁移到其正常定居部位，难以与靶目标建立有效的突触连接，神经细胞凋亡也明显增加。

迄今为止的研究已证明NGFIB-β在中脑黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经细胞分化、迁移、成熟和生存等方面有重要作用［9，10］但中脑以外非典型多巴胺能神经细胞区域蛋白表达状态及意义未见报道，大脑皮层属于非典型多巴胺能神经细胞区域，本研究采用免疫组化观察了大鼠发育过程中大脑皮层NGFIB-β蛋白表达的动态变化，实验结果显示在大鼠大脑皮层发育过程中NGFIB-β的表达呈现了一个较为短暂的显著的动态变化，NGFIB-β首先在E 16 d大脑皮层的深部(第Ⅴ、Ⅵ层)出现少量表达，之后随着发育的进行阳性表达明显增多，生后1～5 d的表达达到高峰且Ⅱ～Ⅵ层均可见多量阳性细胞，P7之后随着细胞的成熟阳性细胞又逐渐减少，P13时阳性表达主要集中在Ⅴ～Ⅵ层，成熟的大脑皮层仅在Ⅴ～Ⅵ层见个别阳性细胞，这种表达呈明显的时间和空间特点，而且NGFIB-β阳性细胞显示已分化的形态，随着细胞的分化成熟阳性表达明显减少，而且大脑皮层组织属于非典型多巴胺能神经细胞区域，可以肯定的说这些阳性细胞并不是多巴胺能神经细胞，本研究提示NGFIB-β在中脑以外非典型多巴胺能区域的大脑皮层组织神经细胞的分化迁移至成熟过程中担当角色。

1 Law SW，Conneely OM，DeMayo FJ，et al.Identification of a new brainspecific transcription factor，NURRl.Mol Endocrinol，1992，6：2129-2135.

2 Le WD，Xu P，Jankovic J，et al.Mutations in NR4A2 associated with familial Parkinson disease.Nat Genet，2003，33：85-89.

3 Wallen A，Zetterstrom RH，Solomin L，et al.Fate of mesencephalic AHD2-expressing dopamine progenitor cells in NURR1 mutant mice.Exp Cell Res，1999，2：737-746.

4 Zetterstrom RH，Williams R，Perlmann T，et al.Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions includeng the nigrostriatal dopamine system.Brain Res Mol Brain Res，1996，1：111-120.

5 Barth PG.Disorders of neuronal migration.J Neurol Sci，1987，14：1-16.

6 Gordon N.Epilepsy and disorders of neuronal migration.II：Epilepsy as a symptom of neuronal migration defects.Dev Med Child Neurol，1996，38：1131-1134.

7 Torii T，Kawarai T.Nakamura S，et al.Organization of the human orphan nuclear receptor Nurr1 gene.Gene，1999，230：225-232.

8 Perlmann T，Jansson L.A novel pathway for vitamin A signaling mediated by RXR heterodimerization with NGFI-Band Nurr.Genes Dev，1995，9：769-782.

9 Chung S，Sonntag KC，Andersson T.Genetic engineering of mouse embryonic stem cells by Nurr1 enhances differentiation and maturation into dopaminergic neurons.Eur J Neurosci，2002，16：1829-1838.

10 Haas SJ，Wree A.Dopaminergic differentiation of the Nurr1-expressing immortalized mesencephalic cell line CSM14.1 in vitro.Anatomy，2002，201：61-69.