DsRNA对小鼠肝细胞干扰素－α的表达影响

张 虎，杜欣娜，张淑红，朱金玲，李春明，赵 璐，胡新俊

（1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154007；2.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江 佳木斯154002；3.佳木斯中心医院，黑龙江 佳木斯154002）

干扰素（Interferon，IFN）主要是糖蛋白，功能多样，具有免疫活性。干扰素在抗病毒、增强免疫力和治疗肿瘤方面作用巨大。一直以来干扰素一直是生命科学领域的研究重点和热点。但是在临床上，干扰素的不足之处在于半衰期短，且容易产生副作用。寻找合适的干扰素诱导剂成为了当今研究的焦点[1]。本课题研究了新鲜香菇dsRNA对于小鼠肝脏细胞的干扰素－α的表达影响，初步探讨其中的机制，为寻找合适的干扰素诱导剂提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

佳木斯大学动物中心提供小鼠30只，体重（20±4）g，随机分为对照组和实验组。新鲜香菇购买于佳木斯市大润发超市。

1.2 实验方法

1.2.1 DsRNA的提取和鉴定

[2，3]，取新鲜香菇10g，液氮研磨，加入2倍体积的STE及酚／氯仿／异戊醇混合液抽提；2000rpm离心；取上清液，加入无水乙醇至终浓度的17%，注入预处理过的纤维素（CF－Ⅱ）柱中，最后用80mL含17%乙醇的1倍体积的STE液洗脱，再用不含乙醇的1倍体积的STE液洗脱；洗脱液用异丙醇、乙醇沉淀，真空抽干，得到dsRNA。

1.2.2 RT－PCR检测干扰素－αmRNA的表达变化

1.2.2.1 动物处理

对照组小鼠不做任何处理，实验组小鼠分为dsRNA注射0.5、5和50mg·kg－1三个组，12h后猝死所有小鼠，取肝脏，液氮保存，备用。

1.2.2.2 小鼠肝脏总RNA提取

TRIZOL法提取总RNA，操作步骤完全按照Invitrogen公司的说明书进行。

1.2.2.3 RT－PCR检测干扰素－αmRNA的表达

① 反转录：依据试剂盒说明书20μL反应体系：

总RNA：2μg；10×反转录缓冲液：2μL；100mM dNTP：0.8μL；10×反转录随机引物：2μL；50u／μL反转录酶：1μL；40u／μL RNA酶抑制剂：0.5μL；DEPC处理过的去离子水：补至20μL。

反转录条件：25℃10min，37℃120min，85℃5sec，反转录后的cDNA－20℃保存待用。

②PCR扩增：IFN－α引物序列：上游5＇CTGTGCTTTCCTGATGGT 3＇，下游5＇GAGTCTAGGAGGGTTGTATT 3＇，产物大小：309bp；

GAPDH引物序列：

上游5’GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3’，

下游5’AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC 3’，产物大小：700bp。

PCR反应体系（20μL）：cDNA：1μL；2×Mix液：10μL；F P：0.5μL；R P：0.5μL；无菌双蒸水：补至20μL

PCR反应条件：

95℃5min，95℃30sec，56℃30sec，72℃50sec，28个循环，72℃5min.

1.3 统计学处理

实验所得数据采用SPSS18.0软件进行t检验，计量资料以±s表示，P＜0.05表示差异具显著。

表1 不同组间干扰素－αmRNA表达变化（n＝6，±s）

表1 不同组间干扰素－αmRNA表达变化（n＝6，±s）

注：＊P＜0.01vs对照组；＃P＜0.01vs 0.5mg·kg－1；＆P＜0.01vs 5mg·kg－1

指 标 对照组 0.5mg·kg－1 5mg·kg－1 50mg·kg－1干扰素－αmRNA 0.34±0.05 0.56±0.08＊ 0.73±0.11＊＃ 0.61±0.09＊＆

2 结果

见表1。

3 讨论

1957年人们首次发现干扰素，生物学活性广泛，具有广谱的抗病毒、免疫调节和抗肿瘤作用，组成了机体防御的重要部分。IFN－α不能直接清除宿主病毒，而是通过抑制病毒复制来完成抗病毒作用，所以临床上一旦停止使用干扰素，往往病情反复，甚至恶化。另外，干扰素容易产生副作用，长期使用对患者造成一定伤害。干扰素诱导剂巧妙的解决了这些问题，诱导剂促使机体本身产生干扰素，副作用不明显[4，5]。

长双链RNA（1ong double str anded RNA，dsRNA）具有较好的干扰素诱导活性。目前研究较多的是聚肌胞（Poly I：C），它是一种人工合成的dsRNA，其具有dsRNA的结构特性，在抗病毒和抗肿瘤的研究中应用较多。细胞膜的表面和胞浆内含有多种dsRNA的识别受体，dsRNA可以通过不同的细胞信号途径来激活机体的非特异性免疫应答。这其中，比较最重要的是TLR3途径和RNA解旋酶RIG－I／MDA5途径[6，7]。本实验提取新鲜香菇天然dsRNA，以不同浓度作用于小鼠，RT－PCR检测了肝脏细胞内IFN－α的表达情况，结果显示实验组干扰素－αmRNA较对照组表达均显著升高 （P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），且浓度为5mg·kg－1dsRNA组干扰素－αmRNA的升高最显著（P＜0.01，P＜0.01）。本实验说明香菇天然dsRNA可以诱使小鼠肝细胞干扰素－αmRNA表达增加。dsRNA可以诱导干扰素生成这一发现为中药抗病毒机制研究提供了一条新思路。中药抗病毒作用机制往往不为西方医药界所认可，原因是中药有效单体成分不明确。目前中药抗病毒研究较多的成分是多糖。本研究提示dsRNA可能是中药抗病毒的 又 一 有 效 成 分。2006 年，RNAi（RNA interference，RNAi）技术获得了诺贝尔奖，小片段dsRNA可以与特定基因互补，特异性地降低或者关闭这基因表达。然而，同为dsRNA，却可以一方面关闭基因的表达（RNAi），另一方面还可以诱导基因的表达（干扰素的生成），这似乎产生了一对“矛盾”，其中的机制未见有人阐述[1]。此外，天然dsRNA的来源、浓度、大小等对于哺乳动物不同组织、细胞的诱导作用的影响有待于进一步研究。天然长dsRNA如何进入细胞、细胞核以及如何诱导基因表达不是很明确，仍需要深入研究。

参考文献：

[1]张虎，梁启超，杜新娜，等.天然dsRNA诱导干扰素生成研究进展[J].黑龙江医药科学，2011，34（3）：54

[2]张晓婷，吴祖建，林奇英，等.双链RNA技术与植物病毒研究[J].云南农业大学学报，2005，20（4）：455－458

[3]李东栋，牛建新，潘立忠.葡萄卷叶病病毒双链RNA（dsRNA）提纯分析研究[J].石河子大学学报（自然科学版），2000，4（3）：205－210

[4]李毅，金一，孙伦泉，等.双链RNA的免疫调节作用及聚肌胞抗病毒应用进展[J].中国生化药物杂志，2011，32（4）：335－338

[5]陈士俊.干扰素α的抗病毒作用机理[J].山东医药，1999，39（24）：38

[6]Vercammen E，Staal J，Beyaert R.Sensing of viral infection and activation of innate immunity by toll－like receptor 3[J].Clin Micro biol Rev，2008，21（1）：13－25

[7]Sasai M，Shingai M，Funami K，et al.NAK－associated protein 1participates in both the TLR3and the cytoplasmic pathways in type I IFN induction[J].J Immunol，2006，177（12）：8676－8683