慢性肾功能衰竭肾阳虚型大鼠肾组织细胞糖皮质激素受体、细胞白介素-1β及肿瘤坏死因子-α的变化*

吴 凡 张红梅 陈雪功 王亿平 董昌武 周雪梅

（安徽中医学院中医临床学院，安徽 合肥 230038）

慢性肾功能衰竭（CRF）是指各种慢性肾病引起的肾小球滤过率下降（GFR＜90 mL/min）和肾脏其他功能损害，及由此产生的代谢紊乱和临床症状组成的综合征［1］。多数CRF患者以肾阳亏虚为本，湿浊内蕴为标。而 CRF 与白介素-1（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等微炎症因子、及糖皮质激素受体（GR）等同肾阳虚型CRF病证结合的研究还未涉及，本实验对肾阳虚型CRF的证候学基础进行进一步的研究。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器 济生肾气丸剂量配比参照《中医方剂大辞典》：熟地黄15 g，山茱萸30 g，牡丹皮30 g，山药30 g，茯苓30 g，泽泻30 g，肉桂 15 g，附子（制）15 g，牛膝15 g，车前子30 g，由安徽中医学院中医门诊部提供。保肾康片（亨达制药，国药准字Z20003105）；IL-1β试剂盒、TNF-α试剂盒由上海森雄实业科技有限公司提供；GR试剂盒由上海源叶生物科技有限公司提供；腺嘌呤由中科院上海生化研究所提供（分子量135.13）、尿蛋白定量试剂盒、尿素氮测定试剂盒、肌酐测定试剂盒由南京建成生物工程研究所生产。尿蛋白定性测试纸由苏州第一制药厂生产 （批号：20110814）。日立7020全自动生化分析仪、Multiskan MK2酶标仪（Labsystem）、Wellwash 4 MK2 洗板机（Labsystem）、UV8100型751紫外可见分光光度计 （北京莱伯泰科仪器有限公司）、800型TGL-168离心沉淀器（江苏金坛市金城国盛实验仪器厂生产）、Olympus BX51型光学显微镜（奥林巴斯公司生产）。

1.2 动物 SD雄性大鼠，体质量（200±20）g，由安徽省动物实验中心提供，批号：SCXK（皖）2011-002。

1.3 分组及造模 40只雄性SD大鼠适应性喂养1周，测尿蛋白（-）。随机分为正常组、模型组、保肾康组、济生肾气丸组，每组10只。参照文献制作CRF肾阳虚动物模型［2］，除正常组外其他3组均以每日200 mg/kg剂量的腺嘌呤灌胃。实验24 d，第1～12日每日灌胃1次，第12日后隔日灌胃1次。

1.4 给药方法 济生肾气丸组和保肾康组均同时分别以每日40 g/kg和33.3 mg/kg的剂量进行预防性治疗，两种药物剂量为中等临床剂量。造模及给药过程中，由于灌胃等因素，模型组死亡1只，济生肾气丸组死亡1只，然后从各组剩余大鼠中随机选取8只用于标本制作和检测。

1.5 标本采集与检测 实验结束前1 d代谢笼收集大鼠24 h尿液。实验结束后，10％水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，冷冻离心（4 ℃，2000 g，10 min）收集血清，-20℃冰箱中保存待测；全自动生化仪检测血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白。左侧肾脏制作病理切片，光镜（×200）下观察肾小球、肾小球囊腔、系膜及系膜基质的病理改变；摘取右侧肾脏组织100 mg，加入PBS缓冲液，按照 1∶9 比例进行匀浆，离心（4 ℃，2000 g，10 min）收集上清液，采用酶联免疫吸附（Elisa）法测定肾脏组织IL-1β，INF-α及GR水平。常规进行梯度稀释标准品、加样、配液、洗板、显色等步骤，在450 nm波长测定各孔吸光度，根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。操作步骤严格按照试剂盒说明进行。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠24 h尿蛋白定量、血清BUN及SCr水平比较 见表1。结果示，模型组大鼠24 h尿蛋白、血清BUN及SCr都显著高于正常对照组（P＜0.05），济生肾气丸及保肾康都能降低24 h尿蛋白、血清BUN及SCr，与模型组差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠肾组织细胞IL-1β、TNF-α及GR水平比较 见表2。模型组大鼠肾组织细胞的IL-1β、INF-α与正常组比较明显升高（P＜0.05），GR明显降低（P＜0.05）；而济生肾气丸组、保肾康组都能降低IL-1β、INF-α，升高 GR，与模型组比较差异明显（P＜0.05）。且济生肾气丸在降低IL-1β、INF-α，升高GR方面更为显著（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠肾组织病理的变化 见图1。正常组的肾小球大小均匀，正常形态，系膜细胞及基质无增生，毛细血管结构清晰。模型组肾小球充血，肾小体数量减少，腺嘌呤代谢结晶占据大部分肾小管和肾小球。肾小管代偿性扩张，大部分肾小管内可见红染的胶冻样管型，部分肾小管被增生的纤维组织所代替，其间可见较多的淋巴细胞浸润；少数肾小球有轻度萎缩，个别肾小球有代偿性肥大。济生肾气丸组：肾小球轻度充血，有少量腺嘌呤代谢结晶沉积，间质有少量炎细胞浸润，血管扩张、有轻度充血。部分肾小管内可见少量粉染分泌物，少数肾小管上皮细胞有脱落。保肾康组：肾小球内中度充血，可见较多腺嘌呤代谢结晶沉积于肾小管和肾小球，部分异形细胞形成。未被累及的肾小管管腔有扩张，管腔内有胶冻样管型沉积，间质内有局灶性纤维组织增生。

表1 各组大鼠24 h尿蛋白定量、血清BUN及SCr水平比较（±s）

表1 各组大鼠24 h尿蛋白定量、血清BUN及SCr水平比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组 别 n SCr（μmol/L）保肾康组 8 154.08±29.86*△正常组 8 63.58±9.82模型组 8 184.34±38.62*济生肾气丸组 8 143.62±27.60*△尿蛋白（mg/24 h）BUN（mmol/L）100.38±13.1*△ 21.08±4.53*△60.57±18.63 7.41±0.8 134.31±15.6* 33.58±7.6*82.21±7.4*△ 20.16±3.32*△

表2 各组大鼠肾组织细胞IL-1β、TNF-α及GR水平比较（pg/mL±s）

表2 各组大鼠肾组织细胞IL-1β、TNF-α及GR水平比较（pg/mL±s）

与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与保肾康组比较，☆P＜0.05。

组 别 n GR保肾康组 8 0.64±0.15*△正常组 8 1.07±0.14模型组 8 0.50±0.09*济生肾气丸组 8 0.787±0.09*△☆IL-1β TNF-α 0.74±0.03*△ 0.82±0.05*△0.35±0.03 0.512±0.03 0.90±0.042* 1.14±0.04*0.55±0.04*△☆ 0.63±0.04*△☆

图1 各组大鼠肾脏组织病理形态变化（HE染色，×200）

3 讨论

CRF是一种常见的临床综合征。该病的发病率高，并且难以治愈，也是困扰当今医学界的一个难题。中医学认为CRF的病机为肾阳亏虚为本，湿浊内蕴为标，治疗上是以温补肾阳兼以化湿泄浊为法。

IL-1β是一种具备多种生物功能的强有力的炎症细胞因子，对体内几乎所有类型的细胞均有作用，可调节许多局部和系统的炎症反应，它通过诱导转录因子激活物蛋白和核因子xB（NF-xB）发挥生物活性，也可促进T细胞的增殖分化及活化，刺激T细胞分泌IL-2、IL-4等细胞因子，促进IL-2受体的表达，参与肾脏的炎性改变。肾小球系膜细胞和内皮细胞等多种细胞亦可分泌IL-1β，IL-1β可通过上调肾小管上皮细胞两种骨架蛋白的蛋白合成和基因表达，诱导肾小管上皮细胞向肾间充质细胞表型发生转化［3］，从而在肾小管间质纤维化发生发展过程中发挥作用。IL-1β可通过影响肾小管上皮细胞发生表型转化（EMT），从而影响肾间质巨噬细胞积聚，以及参与肾纤维化发生与发展［4］。TNF-α是机体炎症和免疫应答的重要调节因子，与炎症的关系极为密切，主要由激活的单核/巨噬细胞、T淋巴细胞所产生，肾脏固有细胞，如系膜细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞均能产生。增高的TNF-α既加重炎症反应及系膜细胞的增殖，促进肾单位受损和肾小球硬化；TNF-α刺激肾小球系膜细胞产生氧自由基，使过氧化脂质代谢产物增多，造成细胞内膜损伤，调动与胶原代谢有关的细胞因子，促进肾小球细胞释放胶原酶，引起蛋白降解，从而加重肾功能损害。TNF-α可以促使白细胞合成，释、放超氧化物和蛋白水解物，引起组织损伤［5］。

本实验发现，模型组IL-1β和TNF-α水平明显升高，提示炎症细胞因子IL-1β及TNF-α在CRF中发挥重要作用，可能对肾小管上皮细胞转化从而促进肾间质纤维化等产生一定的作用，并通过细胞因子的相互作用，共同影响CRF的发生和转归。GR是位于细胞上或细胞内的一类特异蛋白质，与糖皮质激素结合后活化，进入细胞核结合糖皮质激素应答元件，促进磷酸烯醇丙酮酸羧激酶等基因的表达。GR在下丘脑-垂体-靶腺轴（HPA轴）中占有重要地位，HPA轴与肾阳密切相关，GR表达水平的变化是肾阳虚发病过程中的重要环节之一。本实验发现：模型组大鼠的24 h尿pro、BUN、Scr都明显升高，而GR显著降低，并且出现多尿、多饮、精神萎靡，逐渐出现食少、体质量减轻、毛色千枯，耳轮苍白，尾巴湿冷、活动减少、竖毛、蜷缩，外阴周围湿毛等阳虚表现；而济生肾气丸能降低IL-1β、INF-α水平，改善阳虚表现，并升高GR水平。一方面说明腺嘌呤灌胃复制的CRF模型具有肾阳虚病证结合的特点；另一方面也说明济生肾气丸在降低BUN、Scr、改善蛋白尿上和升高GR方面有一定的疗效，从方证相应和疗效反证的角度进一步证明IL-1β、INF-α水平增高、GR水平下降等可能与CRF肾阳亏虚、湿浊内蕴的病理本质密切相关，而调节炎症因子，提高糖皮质受体水平可能成为中医药防治CRF的重要的方法和途径。

［1］叶任高，李幼姬，刘冠贤.临床肾脏病学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2007：530.

［2］傅晓晴，林若勤，武一曼，等.腺嘌呤制作肾阳虚型慢性肾功能衰竭大鼠模型的生化研究［J］.福建中医学院学报，2003， 13（1）：22-24.

［3］杨汝春，鲁盈，朱晓玲，等.白介素-1β 诱导肾小管上皮细胞向间充质细胞转化的实验研究［J］.医学研究杂志，2007，36（11）：33-36.

［4］王光兰，陈 爽，王心蕊，等.白细胞介素1β诱导肾小管上皮细胞转分化及其对细胞骨架的影响［J］.中国免疫杂志，2010，26（3）：210-213.

［5］Navarro-González JF，Mora-Fernández C.The role of inflamma-Tory cytokines in diabetic.Nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19：433-442.