秦艽愈伤组织缓漫生长保存及其生理指标研究△

晋玲，张延红，高素芳

（甘肃中医学院药学系，甘肃 兰州 730000）

秦艽愈伤组织缓漫生长保存及其生理指标研究△

晋玲*，张延红，高素芳

（甘肃中医学院药学系，甘肃 兰州 730000）

目的：筛选秦艽愈伤组织缓慢生长保存的适宜方法，进一步研究保存后愈伤组织形态指标与生理指标之间的相关性。方法：向培养基中添加不同浓度生长抑制剂、高渗化合物及不同基本培养基保存秦艽愈伤组织，在室温下保存6个月后统计愈伤组织的形态学指标。测定不同浓度甘露醇、矮壮素和蔗糖处理中秦艽愈伤组织的生理指标。结果：1.0mg·L－1ABA和9％蔗糖处理中愈伤表面产生大量胚状体，生长良好。5％甘露醇和PEG处理中愈伤黄绿色，生长良好。PP333中愈伤生长一般，CCC中愈伤老化。9％蔗糖处理中可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质含量明显高于其它浓度和甘露醇、矮壮素处理。结论：1.0mg·L－1ABA，9％蔗糖保存秦艽愈伤组织效果最好；5％甘露醇和PEG保存效果良好。可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质3个生理指标可以在一定程度上反映秦艽愈伤组织在延缓保存时的存活情况。

秦艽；愈伤组织；延缓生长保存；形态学指标；生理指标

秦艽为龙胆科植物秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）、麻花秦艽（G.straminea Maxim.）、粗茎秦艽（G.crassicaulis Duthie ex Burk.）和小秦艽（G.dahurica Fisch.）的干燥根，是中药治疗风湿痹痛，关节病必不可少的药物，但由于长期以来过多强调开发利用，盲目采挖，已使野生资源日趋减少，现已被列为国家三级重点保护植物。因此，对其资源进行保护具有十分重要的意义。最近几十年中，以植物组织培养技术为基础的缓慢生长离体保存技术也得到了迅速发展，目前已成功地应用于多种植物种质资源的离体保存［1］。本试验通过在培养基上添加高渗化合物和生长抑制剂对秦艽愈伤组织进行离体保存，6个月后测定愈伤组织的形态和生理指标，旨在筛选秦艽种质资源中短期保存的适宜方法，深入研究这些物质延缓衰老的生理机理。

1 材料及方法

1.1 材料

以秦艽种子发芽小苗的胚轴为外植体，接种在MS＋1.0mg·L－12，4-D＋0.5mg·L－16-BA培养基上诱导产生愈伤组织，在原培养基上6次继代扩繁后，获得大量的愈伤组织做试材。

1.2 方法

1.2.1 本试验采用在愈伤继代培养基上添加不同浓度生长抑制剂：矮壮素（CCC）、脱落酸（ABA）、多效唑（PP333）；高渗化合物：蔗糖、甘露醇、聚乙二醇（PEG）及不同浓度基本培养基保存秦艽愈伤组织，在室温下生长6个月后，统计愈伤量、愈伤质地、颜色、分化情况、生长情况。

1.2.1 将保存6个月的秦艽愈伤组织投入液氮速冻后置于－20℃冰箱中备用。可溶性糖和淀粉含量测定采用蒽酮法，可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法［2］。

2 结果与分析

2.1 不同类型和浓度的生长抑制剂、高渗化合物及基本培养基对秦艽愈伤组织的形态学影响

2.1.1 不同类型和浓度的生长抑制剂对秦艽愈伤组织的形态学影响 由表1可知，不同浓度CCC处理，愈伤组织增殖量均很大且分化出少量试管苗，但愈伤生长不良，颜色褐色或暗黄绿，呈老化态。因此，CCC不适于秦艽愈伤组织延缓生长保存。不同浓度PP333处理中，愈伤组织部分呈黄白色，部分褐化死亡。低浓度PP333中愈伤生长情况好于高浓度，且产生少量胚状体。高浓PP333中愈伤褐化严重，无分化。在1.0mg·L－1ABA处理中，愈伤呈黄色颗粒状，有大量胚状体产生，生长良好，是一种有效的保存方法。

2.1.2 不同类型和浓度的高渗化合物对秦艽愈伤组织的形态学影响 在培养基中添加一些高渗化合物如蔗糖、甘露醇、山梨醇等也是一种常用的缓慢生长保存手段，它们通过提高培养基的渗透势负值，造成水分逆境，降低细胞膨压，使细胞吸水困难，同时细胞壁酶活性受到抑制，减弱新陈代谢活动，延缓细胞生长［3］。由表2可知，不同类型和浓度的高渗化合物保存秦艽愈伤效果的差异较大，在低浓度3％和6％蔗糖处理中，愈伤组织增殖量大，但愈伤老化，生长不良。9％蔗糖处理中，愈伤增殖量少，呈黄色颗粒状，并分化出大量胚状体，生长良好。因此，9％蔗糖处理可作为一种适宜的秦艽愈伤组织中短期保存的方法。在不同浓度甘露醇处理中，5％甘露醇愈伤增殖量不大，愈伤黄绿色，生长良好，说明该浓度保存效果良好。过高或过低浓度的甘露醇处理均不适于秦艽愈伤保存。PEG处理中愈伤组织呈黄绿色，增殖量较多，但生长势较好，保存效果良好。

表1 不同类型和浓度的生长抑制剂对秦艽愈伤组织的形态学影响

表2 不同类型和浓度的高渗化合物对秦艽愈伤组织的形态学影响

2.1.3 不同浓度基本培养基对秦艽愈伤组织的形态学影响 从表3可以看出，不同浓度MS培养基保存效果均不良。愈伤组织呈褐色，死亡。因此，在室温条件下，单纯地增加或减少基本培养基中的营养物质无法达到保存的目的。要取得良好的保存效果，必须在培养基中附加高渗化合物或生长抑制剂。

表3 不同浓度基本培养基对秦艽愈伤组织的形态学影响

2.2 不同种类和浓度的生长抑制剂与高渗化合物对秦艽愈伤组织中可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质含量的影响

从表 4得知，在 10mg·L－1、20mg·L－1与 50mg·L－1CCC处理中可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质含量之间差异不大，且很低。结合形态学指标来看，3种浓度处理后愈伤组织均表现出老化衰亡迹象，在生理指标上和形态学上表现了一致性。

5％甘露醇处理的愈伤组织中可溶性糖、淀粉和蛋白质的含量均明显高于2％和10％的甘露醇处理及矮壮素各浓度处理。而且从形态学指标来看，5％甘露醇处理中愈伤生长量少，呈现黄绿色，愈伤组织状态良好，因此，可作为一种有效的秦艽愈伤延缓生长的方法。与5％甘露醇处理相比，过低或过高浓度的甘露醇处理中愈伤组织保存效果都不良，且可溶性糖、淀粉和蛋白质的含量也均有所降低。

表4 不同浓度CCC、甘露醇和蔗糖处理中愈伤组织的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质含量

9％蔗糖处理中可溶性糖、淀粉和蛋白质的含量都明显高于其它浓度处理，也高于5％甘露醇处理。从测得的形态指标来看，9％蔗糖处理中的愈伤组织生长量少，分化出大量黄色米粒状的胚状体，保存效果最好。4％和6％蔗糖处理中愈伤组织生长量多，色泽暗淡，趋于老化，而且其可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质的含量也较低。

因此，可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质的含量在一定程度上可反映出愈伤组织的生长情况。在高渗化合物处理时，植物细胞可能主要通过增加其体内的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质含量来增强其在高渗环境中的生存能力。

3 结论与讨论

3.1 本试验研究结果表明，不同类型和浓度的高渗化合物对秦艽愈伤组织保存效果的影响差异较大。9％蔗糖浓度处理中愈伤存活，增殖量不多，呈黄色颗粒状，分化出大量胚状体，且其可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质的含量均高于其它处理，是秦艽延缓生长保存的有效方法。

3.2 5％甘露醇处理中愈伤生长良好，增殖量少，2％和10％甘露醇处理效果不佳，老化或死亡。同时生理指标测定结果表明，5％甘露醇处理的愈伤组织中可溶性糖、淀粉和蛋白质含量均高于2％和10％甘露醇处理。PEG处理下愈伤组织增殖量较多，呈黄绿色，生长良好。1.0mg·L－1ABA处理中愈伤生长良好，增殖量少，并分化出大量胚状体。因此，以上几种方法均可用作秦艽愈伤组织的中短期保存。

3.3 CCC处理中愈伤增殖量最大，但愈伤均老化，其可溶性糖、淀粉和蛋白质含量也较其它有效保存处理低。故CCC不适宜于秦艽愈伤组织延缓生长保存。在室温条件下，单纯地增加或减少基本培养基中的营养物质无法达到中短期保存的目的。PP333的保存效果一般。

3.4 在逆境条件下（低温，高温，干旱等），有的植物对逆境具有适应能力或抗性，有的植物对逆境较为敏感。当胁迫超出了植物正常生长、发育所能承受的范围将导致植物体内产生一系列的生理生化变化，如可溶性糖、淀粉含量、可溶性蛋白质等，植物受到伤害甚至死亡［4］。本研究表明高渗化合物甘露醇和蔗糖处理时，秦艽组织可能通过提高体内的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白质含量来应对高渗逆境。

3.5 不同的高渗化合物和生长抑制剂，延缓生长保存愈伤组织的策略不同，一种是诱导产生大量胚状体，一种是形成大块黄绿色或黄白色愈伤组织，其机理还有待进一步的深入研究。有研究表明向培养基中添加ABA和高浓度的蔗糖，有利于胚状体的诱导［5］，诱导获得的胚状体可较长时间地处于休眠状态。本研究也得到了类似的结果，9％蔗糖和1％ABA处理中均分化出大量黄色颗粒状胚状体。胚状体像合子胚一样处于休眠状态，没有萌发成苗，可能是一种良好的保存状态，保存的时间更长。将延缓生长保存6个月的黄色颗粒状胚状体转接在1/2MS培养基上，胚状体的子叶转绿，并开始伸长生长，试管苗形态正常。但柿的试管苗延缓生长保存表明，ABA不太适宜于中短期保存［6］。因此，对于通过胚状体发生途径再生植株的药用植物可以通过本研究筛选的方法尝试保存植物材料。

3.6 在秦艽愈伤组织延缓生长保存中发现，无论哪种处理，同一瓶中的愈伤组织总会以牺牲极少部分愈伤为代价来保全多数愈伤的生存。这可能是延缓生长保存的又一策略。

［1］张俊，蒋桂华，敬小莉，等.我国药用植物种质资源离体保存研究进展［J］，世界科学技术—中医药现代化，2011，13（3）：556-560.

［2］张志良主编.植物生理实验指导［M］，北京：高等教育出版社，2009.

［3］陈辉，陈晓玲，陈龙清，等.百合种质资源限制生长法保存研究.园艺学报［J］，2006，33（4）：789-793.

［4］吴能表，吴俊岩，朱利泉，等.低温对甘蓝逆境生理指标和蛋白质磷酸化的影响［J］，园艺学报，2003，30（5）：530-534.

［5］王蒂主编.植物组织培养［M］，北京：中国农业出版社，2004.

［6］艾鹏飞，罗正荣.柿和君迁子试管苗缓慢生长法保存及其遗传稳定性研究［J］，园艺学报，2004，31（4）：441-446.

Studies on M ethod for the Callus of Gentiana macrophylla Pall.Slow ly Grow ing and Its Physiological Index

JIN Ling*，ZHANG Yan-hong，GAO Su-fang
（Department of Herbs，Gansu College of TCM，Lanzhou 730000，China）

Objective：An appropriate conservation method for callus of Gentiana macrophylla Pall.slowly growing，and the relationship of physiological index and morphological index of the conserved callus were studied.M ethods：To conserve callus，growth inhibitors and high permeability compounds were added to the medium，or different concentration of basic medium were used.After the callus was conserved for six month at room temperature，the morphological index was recorded and physiological index of the conserved callus of Gentiana macrophylla with different concentration ofmannitol，CCC and sucrose were measured.Results：A large number of embryoid were generated in the surface of callus with the treatment of 1.0mg/L ABA and 9％sucrose and grew well.The callus showed yellow-green and grew well under the treatmentwith 5％mannitol and PEG.Callus in PP333 grew commonly and callus in CCCwas aging.Under the treatmentwith 9％sucrose，soluble sugar，starch and soluble protein content were significantly higher than treated with the other concentration of sucrose，mannitol or CCC.Conclusion：The best condition for callus conservation of Gentiana macrophylla was 1.0mg/L ABA and 9％sucrose，followed by 5％mannitol and PEG.Soluble sugar，starch and soluble protein can partly reflect the survival rate of the callus conservation slowly growing.

Gentiana macrophylla Pall.；Callus；Slow growth conservation；Morphological index；Physiological index

2012-09-29）

甘肃省中医药管理局项目（GZK-2012-Z2）；国家中医药管理局项目（04-C52L23）

*［通讯作者］晋玲，Tel：（0931）8765495，E-mail：zyxyjl＠163.com