CYP3A5基因型与肾移植受者他克莫司药物代谢的相关性研究

周 晔，傅尚希，朱有华，唐晓峰＊

（上海长征医院1.输血科；2.器官移植中心，上海200003）

他克莫司是大环内酯类基础免疫抑制剂，广泛用于器官移植术后预防和治疗排异反应［1］。它具有治疗窗窄、个体间药物代谢动力学差异大的特点，目前一直采用监测血药浓度的方法调整用药剂量。通过药物基因组学的研究，Evans等人发现由于药物吸收、分布的差异导致不同个体间疗效及不良反应的差异。大量的研究表明，他克莫司通过细胞色素氧化酶P450（CYP）3A5代谢。CYP3A5在10%－97%的人群中表达，在有表达的人群中其活性占体内CYP3A总活性的2%－60%，且表达呈多态性，被认为是个体间CYP3A活性差异（相差约10－40倍）的最主要因素［2］。CYP3A5最多见的突变位点在内含子3（6986A＞G），突变型的纯合子个体即CYP3A5＊3/＊3型的个体不表达CYP3A5酶，导致肝脏或肠道CYP3A5酶活性严重降低或缺失［3］。本研究通过观察不同的CYP3A5基因型与他克莫司血药浓度/剂量比的关系，旨在为免疫抑制剂的个体化用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2010－2011年间在上海长征医院施行肾移植手术，并且以他克莫司为基础免疫抑制剂的患者74例。其中男性45例，女性29例，年龄（36.25±8.56）岁（19－58岁），体重（57.89±12.12）kg（43－78kg）。术后采用Tac＋霉酚酸酯＋强的松三联免疫抑制方案防止排异反应。

1.2 患者全血DNA抽提 用含109mmol/L枸橼酸钠抗凝剂0.5ml的真空抽血管无菌抽取血液4ml，立即颠倒混匀。采用美国QIAGEN公司的DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA。采用DU640型紫外分光光度仪（Beckman，Fullerton，CA，USA）测定提取的DNA浓度，分别测定260 nm和280nm波长下的吸光度值，计算DNA的浓度。DNA产物置冰箱－20℃备用。

1.3 患者CYP3A5基因分型 根据CYP3A5基因的第3内含子6986A〉G单核苷酸多态性是引起酶活性差异的特点，设计聚合酶链反应（PCR）扩增片段为 427bp，正 引 物 5′－GAA GCA AGT GGG AGA AAG－3′，负 引物 5′－TGA TGA AGG GTA ATG TGG－3′，委托上海生工生物工程公司合成。采用美国QIAGEN公司PCR－Hotstar Taq Master Mix试剂盒扩增目的片段。反应体系共25μl，其中蒸馏水9μl，正引物0.5μl，负引物0.5μl，HotStar Taq Master Mix 12.5μl，Template DNA 2.5μl。PCR反应条件为95℃预变性15分钟，变性、退火、延伸分别为94℃45s，58℃30s，72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物送上海生工生物工程公司测定基因序列。

1.4 免疫抑制方案 术后常规给予甲基泼尼松龙（MP）0.5g/d静滴，连续三天，于第4天改口服泼尼松80mg/d，以后每日递减10mg至20mg/d维持，术后3月降至15mg/d，术后6月降至10mg/d，术后1年降至5mg/d；MMF手术当日口服2.0g，术后第一天开始1.5g/d维持；Tac在术后血肌酐＜400μmoL/L以下开始服用，CYP3A5＊1/＊1型和CYP3A5＊1/＊3型初始剂量0.15mg/（kg.d），CYP3A5＊3/＊3型初始剂量0.1mg/（kg.d）。以后根据目标浓度来调整Tac剂量，一般术后3月内血药谷值浓度控制在6－10ng/L左右、以后控制在6 ng/L左右。

1.5 Tac血药浓度测定 患者于前一日晚8时服用Tac，次日早晨8时服药前抽血1ml，15%EDTA抗凝，采用美国雅培公司ARCHITECT i1000SR全自动免疫分析仪检测Tac浓度谷值（C0）。统计时将血药浓度的结果变换为浓度/剂量比进行分析，即以血药浓度（ng/ml）除以Tac剂量［mg/（kg.d）］。

1.6 统计分析 Tac的血药浓度和剂量的比较采用非参数统计方法分析，两组间的比较采用Mann－Whitney U检验，多组间的比较使用Kruskal－Wallis检验。用χ2检验分析等位基因分布是否符合Hardy－Weinberg平衡，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CYP3A5基因分型 聚合酶链反应扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，可见一条明显的长度为427 bp的条带，见图1。测序结果与人类Genbank（AC005020）中的 CYP3A5基因序列比较，在CYP3A5基因6986A＞G中，确定对应的突变类型。见图2，CYP3A5＊1/＊1型表现为“AA”纯合子单峰曲线，CYP3A5＊1/＊3型表现为“AG”杂合子双峰曲线，CYP3A5＊3/＊3型 型表现为“GG”纯合子单峰曲线。74例肾移植受者CYP3A5基因型分别为 CYP3A5＊1/＊1型5例（6.8%）、CYP3A5＊1/＊3型34例（45.9%）、CYP3A5＊3/＊3型35例（47.3%）。等位基因分布符合 Hardy－Weinberg平衡（P＞0.05）。

图1 CYP3A5目的基因扩增产物电泳图

2.2 CYP3A5基因型与他克莫司血药浓度/剂量比的关系 在肾移植术后半年以上稳定期以服用他克莫司为基础的抗排异反应患者，分别测定术后1、2、4周及第3、6个月他克莫司血药浓度。CYP3A5＊3/＊3型患者他克莫司血药浓度/剂量比与CYP3A5＊1/＊1型、CYP3A5＊1/＊3型比较，差异有统计学意义（P＜0.01），CYP3A5＊1/＊1型与CYP3A5＊1/＊3型比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同CYP3A5基因型患者血Tac浓度/剂量比值

图2 CYP3A5多态性典型基因测序图

3 讨论

他克莫司广泛应用于器官移植，它治疗窗窄和血药浓度个体间差异大成为临床合理有效用药的一个难点。他克莫司口服后主要在空肠和回肠吸收，在肠道和肝脏代谢，其口服生物利用度为4%－89%，个体间差异非常大［4］。研究发现，细胞色素P450 3A（CYP3A）酶系中的CYP3A5基因多态性是影响他克莫司血药浓度的重要因素。CYP3A5的表达与活性呈高度多态性、有广泛的个体及种族间差异［5－6］。

CYP3A5活性差异主要是由单核苷酸的多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）造成的，基因差异是CYP3A5表达的主要调控方式。CYP3A5基因位于人类第7号染色体q21.1－22.1，基因全长为31.8kb，有13个外显子，编码502个氨基酸［7］。CYP3A5第3内含子3（6986A＞G）的突变，使纯合子个体即CYP3A5＊3/＊3型的个体不表达CYP3A5酶，导致肝脏或肠道CYP3A5酶活性严重降低或缺失［8］。

我们研究发现，CYP3A5基因型与肾移植受者他克莫司药物的代谢显著相关，分析CYP3A5基因型可以为肾移植患者个体化用药提供可靠的依据。我们给CYP3A5＊3/＊3型患者他克莫司初始剂量为0.1m/（kg.d），给CYP3A51/＊1型和CYP3A5＊1/＊3型患者初始剂量为0.15mg/（kg.d），发现同样可以达到目标治疗浓度。CYP3A5基因多态性显著影响FK506的血药浓度，不同基因型的患者需要的药物剂量不同，CYP3A5＊1/＊1型和CYP3A5＊1/＊3型患者由于浓度/剂量比低，需要更大的剂量以达到治疗浓度，而CYP3A5＊3/＊3型患者需要相对较小的剂量以免出现过度的免疫抑制剂毒性的发生。临床医生可以根据不同CYP3A5基因型对药物代谢的特点，调整他克莫司的起始剂量，以提高他克莫司的疗效，减少其副作用。

［1］陈国栋.他克莫司在肾移植中应用新进展［J］.器官移植，2011，2（1）：46.

［2］Tateishi T，WatanabeM，MoriyaxH，et al.No ethnic differences betweenCaucasian and Japanese samples in the expression frequency of CYP3A5and CYP3A7proteins［J］.Biochem Pharmacol，1999，57：935.

［3］陈艳梅，刘丽宏，王熙然，等.健康受试者他克莫司代谢与CYP3A5基因多态性的相关性［J］.山东医药，2009，49（9）：28.

［4］Wallemacq PE，Verbeek RK.Comparative c1inica1pharmacokinetics of tacrolimus in pediatric and adult patients［J］.Clin Pharmacokinet，2001，40 （3）：283.

［5］DuricováJ，Grundmann M.Clinical significance of cytochrome P450genetic polymorphism－part IV.Cytochrome P450 3A4and 3A5［J］.Ceska Slov Farm，2011，60（6）：276.

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