当归多糖对衰老模型小鼠学习、记忆能力及脑组织凋亡蛋白表达的影响*

李雪燕，陈开兵，张丽云

(1.甘肃中医学院，甘肃 兰州730000;2.甘肃中医学院附属医院，甘肃兰州730000)

当归为伞形科植物当归的干燥根，味甘、辛，性温，归肝、心、脾经，具有补血活血、调经止带、润肠通便等功效，在临床中被广泛应用［1］。当归多糖为当归的有效成分之一，有研究［2］报道其具有延缓衰老的作用，但机制尚不十分清楚。本研究通过观察当归加多糖对D－半乳糖和亚硝酸钠联合腹腔给药所致亚急性衰老拟痴呆模型小鼠的学习、记忆能力及凋亡相关蛋白表达的影响，从细胞凋亡角度进一步探讨其延缓衰老的机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量(20±2)g，由甘肃中医学院科研动物中心提供，实验动物合格证号:SCXK(甘)2011－0001－0001126。

1.2 药品、试剂与仪器

当归多糖，陕西慈缘生物技术有限公司生产，批号CY110320，用生理盐水配制成10 g/L的储备液，备用;脑复康，湖南迪诺制药有限公司生产，批号101110。D－半乳糖，北京化学试剂公司产品，批号020123，临用前用生理盐水配制成12 g/L备用;亚硝酸钠，西安化学试剂厂产品，批号860723，临用前用生理盐水配制成9 g/L备用;Bcl-2蛋白ELISA试剂盒(批号20120703)和Bax蛋白ELISA试剂盒(批号20120715)，上海江莱生物科技有限公司产品。SK3300H型数控超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司产品;BS224S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品;HH－4数显恒温水浴锅，郑州杜甫仪器厂产品;XYJ80－20型离心机，金坛市恒丰仪器厂产品;XW－80A型旋涡混匀器，上海精科实业有限公司产品;ZY12306型微量加样器，ScienTiFic公司产品;WGC小鼠水迷宫，安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司产品;RT－6100型酶标仪，美国Rayto公司产品。

1.3 动物分组、给药与模型的建立

将72只小鼠按照随机数字表法分为空白对照组，模型对照组，脑复康组，当归多糖低、中、高剂量组6组，每组12只。除空白对照组外，其余各组每日腹腔注射 D－半乳糖 120 μg/g和亚硝酸钠90 μg/g［2－3］联合给药建立衰老小鼠模型;空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水，连续30 d。30 d后，在腹腔注射的同时，脑复康组给予脑复康200 μg/g，当归多糖高、中、低剂量组分别按照 400，200，100 μg/g灌胃给药;模型对照组及空白对照组灌服等体积的生理盐水，连续6周。

1.4 检测指标

1.4.1 学习成绩和记忆成绩

末次给药后，进行Y型迷宫试验［4］。迷宫共分为3个互通的臂，实验测试时，加入温水(维持25±2℃)，使水面高于平台约1 cm，再加入原味奶粉，使水成不透明乳白色。工作电压50～70 V。以A为起步区，B为安全区，C为危险区。小鼠在起步区受到电击后，1次性跑入安全区为正确，否则为错误，此即为1次训练。下1次训练以B为起步区，C为安全区，A为危险区，依次往复。共训练33次，其中前3次作为小鼠适应环境不进入统计，记录后30次中的错误次数，为学习成绩。24 h后，用同样的方法测试，为记忆成绩。

1.4.2 脑组织生化指标

Y型迷宫测试后，将小鼠快速断头处死，取其脑组织用生理盐水制成10 g/L脑匀浆，3 000 r/min低温离心10 min，取上清液备用。ELISA法测定Bcl-2蛋白和Bax蛋白含量。具体步骤严格按照试剂盒说明书执行。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠学习和记忆成绩对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠学习记忆能力下降，表现为学习成绩和记忆成绩测试中的错误次数增多，差别有统计学意义(P＜0.01)，说明造模成功。与模型对照组对比，脑复康组和当归多糖3个剂量组小鼠学习和记忆中的错误次数均减少，差别有统计学意义(P＜0.01或 P＜0.05)，尤以当归多糖中、高剂量组明显(P＜0.01)，且此两组与脑复康组对比，差别亦有统计学意义(P＜0.01或 P＜0.05)。见表 1。

表1 各组小鼠学习和记忆成绩对比 ±s

表1 各组小鼠学习和记忆成绩对比 ±s

注:与空白对照组对比，＊＊P ＜0.01;与模型对照组对比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与脑复康组对比，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01。

组 别 动物数 剂量/(μg·g－1) 每30次中错误次数学习成绩/次 记忆成绩/次12 － 17.07 ±1.39 14.40 ±1.50模型对照组 12 － 19.07±1.83＊＊ 17.01±1.36＊＊脑复康组 12 200 16.27 ±1.49## 14.93 ±1.03##当归多糖低剂量组 12 100 17.07 ±1.39# 15.60 ±1.24#当归多糖中剂量组 12 200 14.53±1.46##△ 13.40±2.59##△当归多糖高剂量组 12 400 14.07±1.28##△△ 12.80±2.18##△△空白对照组

2.2 各组小鼠脑组织Bcl-2和Bax蛋白含量对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠脑组织Bcl-2和Bax蛋白的含量均升高，差别有统计学意义(P＜0.01)。与模型对照组对比，脑复康组和当归多糖3个剂量组Bcl-2蛋白含量增高、Bax蛋白含量降低，差别有统计学意义(P＜0.01或 P＜0.05)。与脑复康组对比，当归多糖高剂量组Bcl-2蛋白含量增高、Bax蛋白含量降低，差别有统计学意义(P＜0.01)。见表 2。

表2 各组小鼠脑组织Bcl-2和Bax蛋白含量对比 ±s

表2 各组小鼠脑组织Bcl-2和Bax蛋白含量对比 ±s

注:与空白对照组对比，＊＊P ＜0.01;与模型对照组对比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与脑复康组对比，△△ P ＜0.01。

组 别 动物数 剂量/(μg·g－1) Bcl-2蛋白/(μg·L－1) Bax蛋白/(μg·L－1)12 － 2.60 ±0.46 4.66 ±0.42模型对照组 12 － 3.33±0.43＊＊ 6.11±1.20＊＊脑复康组 12 200 4.14 ±0.56## 5.35 ±0.41##当归多糖低剂量组 12 100 3.87 ±0.45# 5.54 ±0.48#当归多糖中剂量组 12 200 4.36 ±0.37## 4.99 ±0.52##当归多糖高剂量组 12 400 5.03±0.25##△△ 4.62±0.33##△△空白对照组

3 讨论

细胞凋亡是一个主动的、有序的、受控的过程，参与调控的基因目前已发现几十个，按其功能可分为促凋亡基因(如Bax，p53，Caspase等)和抗凋亡基因(如 Bcl-2，Bcl-x，Hsp等)两大类，由这些基因编码的蛋白质产物参与决定了细胞的存活或死亡［5－6］。促凋亡基因和抗凋亡基因组成一个平衡体系，任何因素破坏这一平衡体系就会导致细胞对外界的敏感性增加，从而破坏其结构和功能。多种因素导致的细胞凋亡和多种因素的抗凋亡作用都会通过调控 Bcl-2 家族的表达而完成［7－8］。因此，Bcl-2和Bax在脑衰老的发生和发展中起到重要作用，Bcl-2和Bax的表达强度决定细胞命运，Bcl-2占优势时细胞生存，Bax占优势时细胞死亡［9］。

已有研究［1－2］证实，当归及当归多糖确有延缓衰老的作用，但对其机制的研究主要集中于自由基学说。鉴于此，本实验进一步检测了当归多糖对亚急性衰老拟痴呆模型小鼠学习、记忆能力及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。结果表明:造模后，在机体的自我保护机制下，Bcl-2蛋白表达反应性增强，且启动了凋亡程序，Bax表达增强，破坏了Bcl-2/Bax基因平衡，导致Bcl-2/Bax的比值下降，促进细胞凋亡的发生。药物干预后，当归多糖低、中、高剂量组均能使小鼠脑组织中Bcl-2表达增强，Bax表达减弱，Bcl-2/Bax的比值增高，抑制细胞凋亡，从而达到延缓衰老，改善衰老模型小鼠学习、记忆能力的目的，尤以高剂量组最为明显，差别有统计学意义(P＜0.01)。说明当归多糖低剂量已表现出不同程度的延缓衰老作用，高剂量作用更为理想。然而，细胞凋亡是通过一系列连锁反应实现的，涉及不同基因及其产物的调控和信号传递系统的正负调节，故当归多糖抑制脑细胞凋亡的信号转导机制有待进一步深入研究。

［1］李丽丽，刘向前，张晓丹.当归属植物研究进展［J］.中成药，2009，31(4):601 －607.

［2］徐露，董志.当归多糖抗衰老的实验研究［J］.激光杂志，2008，29(4):89 －90.

［3］张妍.复方丹参对早老性痴呆动物的作用及机制研究［D］.北京:北京中医药大学，2008.

［4］王跃春，王子栋，孙黎明，等.动物学习记忆能力的Y－型迷宫测试法［J］.暨南大学学报:自然科学版，2001，22(5):137.

［5］Kerr JF，Wyllie AH，Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，1972，26(4):239.

［6］Williams GT，Smith CA.Molecular regulation of apoptosis:genetic controls on cell death［J］.Cell，1993，74(5):777.

［7］Desagher S，Martinou JC.Mitochondria as the central control point of apoptosis［J］.Trends Cell Biol，2000，10(9):369.

［8］Parone P，Priault M，James D，et al.Apoptosis:bombarding the mitochondria［J］.Essays Biochem，2003，39:41 －51.

［9］Su JH，Anderson AJ，Cummings BJ，et al.Immunohistochemical evidence for apoptosis in Alzheimer＇s disease［J］.Neuroreport，1994，5(18):25 －33.