HPLC法测定坤灵丸中芍药苷的含量

郭 强，王 梅

(1.河南省食品药品检验所，河南 郑州450003；2.河南省中医药研究院附属医院，河南郑州450004)

坤灵丸是《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第十册中的品种［1］，由香附(制)、甘草、白薇、益母草、黄芪、鸡冠花、麦冬、五味子、地黄、红花、川木通、白术(炒)、赤石脂、茯苓、厚朴、肉苁蓉(制)、白芍(酒炒)、荆芥、牡丹皮、阿胶、当归、藁本、红参、鹿角胶、川贝母、没药(炒)、砂仁、延胡索、小茴香(盐制)、龟甲胶、川芎等32味纯中药组成的复方制剂，具有调经止血、逐瘀生新的功能，用于月经不调、行经腹痛、子宫寒冷、久不受孕、习惯性流产等症的治疗。原标准无含量测定项目，通过研究，制定了高效液相色谱法测定白芍和牡丹皮中芍药苷的含量［2］。该方法简便，快速，灵敏，重现性好，可用于该产品质量控制。

1 药品、试剂与仪器

坤灵丸样品由河南广宇博科生物制药有限公司提供，批号为050624，050625，050626。芍药苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，为含量测定用对照品，批号为110736-200630；乙腈为色谱醇，供流动相配制用，Merck公司产品；水为超纯水；甲醇为分析纯。安捷伦1 100高效液相色谱仪，配四元泵、自动进样器、VWD紫外检测器，G1314B；KQ-300型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(实验中用Agilenttm C184.6 mm ×250 mm，5 μm)，乙腈 － 水(13∶87)为流动相，体积流量 1.0 mL/min，柱温35℃。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2 000。

在此条件下对芍药苷对照品溶液、坤灵丸供试品溶液进行测定，HPLC色谱结果均较为理想，同法制备的坤灵丸阴性样品(即不含白芍和牡丹皮药材的坤灵丸)测定结果则为阴性，即未见与芍药苷对照品保留时间相一致的吸收峰，说明其他药材对样品测定无干扰。色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

对照品溶液：精密称取芍药苷对照品14.96 mg，置100 mL量瓶中，加入甲醇溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加入甲醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1 毫升中含芍药苷14.96 μg)。

供试品溶液：取本品适量，除去包衣，研细；取约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中；精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理(功率 250 W，频率50 kHz)40 min，放冷；再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图1 芍药苷对照品、样品、缺白芍和牡丹皮药材的阴性样品的HPLC色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

取芍药苷对照品溶液，分别制成浓度为2.34，4.68，9.35，18.7，37.4，74.8 μg/mL 的 6 个样品，分别吸取上述溶液各10 μL进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值对进样量进行回归处理，芍药苷在0.023 4 ～0.748 0 μg范围内，呈现良好的线性关系。回归方程为 Y=95.05X+1005.78，r=0.999 99。

2.3.2 精密度试验

取同一芍药苷对照品溶液，按上述色谱条件，连续测定6次(进样量10 μL)，测得峰面积积分值分别为 1021.326，1015.941，1016.043，1022.053，1019.959，1019.852，结果平均峰面积积分值为1019.196，RSD=0.26%(n=6)。结果表明：该方法精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，按上述色谱条件分别在第0，2，4，6，8 h 各进样 1 次，每次进样 10 μL，测得峰面积积分值分别为 1035.405，1040.253，1032.568，1030.476，1042.635，结果平均峰面积积分值为1036.267，RSD=0.49%(n=5)。结果表明：供试品溶液在8 h内稳定。

2.3.4 重现性试验

取同一批号的样品(批号为050624)6份，按含量测定方法试验，结果测得每1 g样品中含芍药苷分别为 0.28，0.27，0.26，0.28，0.27，0.29 mg，结果平均含量为 0.28 mg/g，RSD=3.81%(n=6)。结果表明：该法重现性较好。

2.3.5 回收率试验

精密称取已知含量的本品(批号050626，芍药苷含量 0.30 mg/g)6 份，每份约1.5 g，精密称定，精密加入芍药苷对照品溶液(0.023 9 mg/mL)20 mL，以下按供试品溶液的制备项下方法制备加样供试品溶液。按上述色谱条件测定，结果见表1。计算回收率，平均回收率为 99.66%，RSD=1.56%(n=6)。

表1 芍药苷回收率测定结果

2.4 样品测定

按含量测定方法测定3批样品中芍药苷的含量，结果见表2。

表2 3批样品测定结果 n=3

3 讨论

本文建立了高效液相色谱法测定坤灵丸中芍药苷含量的方法。该方法简便准确，快速灵敏，重现性好，可用于该产品定量控制。

3.1 含量测定方法的建立依据

本方由31味中药组成，功效为调经养血、逐瘀生新，用于月经不调(或多或少)、行经腹痛、久不受孕、习惯性流产、赤白带下、崩漏不止、病久气虚、肾亏腰痛等症的治疗。方中白芍平肝止痛，养血调经，敛阴止汗，用于治疗头痛眩晕，胁痛，腹痛，四肢挛痛，血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗；牡丹皮清热凉血，活血化瘀，用于治疗温毒发斑，夜热早凉，无汗骨蒸，经闭痛经，痈肿疮毒，跌扑伤痛。这两味药功效与本品一致，原标准无含量测定项，参照相关文献［3－10］，经试验建立了用高效液相色谱法测定白芍、牡丹皮中芍药苷的含量。该方法操作简便、结果准确，可作为本品成品的质控方法。

3.2 提取条件的选择

根据芍药苷的理化性质，芍药苷在甲醇中溶解度比较大，故选用甲醇作为芍药苷的提取溶剂。对加入甲醇的体积进行了考察并优选合适的加入量，通过比较并考虑到容量管的容量，最后选定甲醇的加入量为25 mL；同时又对超声时间进行了考察优选，超声处理时间比较了20，40，60 min，考虑到将样品中芍药苷提取完全即可，最后确定超声时间为40 min。最后确定加入甲醇25 mL，超声处理40 min能够将本品中芍药苷提取完全，根据实验结果把优选出的方法确定为本品中白芍、牡丹皮中芍药苷的提取方法。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：96.

［2］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂：第十册［M］.北京：中华人民共和国卫生部，1994：84.

［3］王巧，刘荣霞，毕开顺，等.HPLC法测定白芍总苷胶囊中芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷［J］.中草药，2005，5(11)：1630.

［4］冀兰鑫，傅俊曾，黄浩，等.赤芍中氧化芍药苷和芍药苷的含量测定［J］.亚太传统医药，2010，8(7)：18.

［5］罗云.HPLC法测定归芎合剂中芍药苷的含量［J］.内蒙古中医药，2009，18(6)：42.

［6］张良，王珊，闵盛.HPLC法测定治偏痛颗粒中芍药苷的含量［J］.中国实用医药，2007，2(18)：74.

［7］李伟，张建军，王卫茜.高效液相色谱法测定白芍药材中芍药苷和芍药内酯苷的含量［J］.中药与临床，2011，2(6)：8.

［8］惠婷婷，夏忠庭，张兰兰.HPLC法测定郁舒颗粒芍药内酯苷和芍药苷的含量［J］.陕西中医，2012，33(4)：480.

［9］刘翔.HPLC法同时测定麻仁丸中芍药苷、柚皮苷及橙皮苷的含量［J］.中国药品标准，2010，11(6)：442.

［10］孟宪波，郑晖.HPLC法测定柴芍丸中芍药苷、栀子苷及丹皮酚的含量［J］.中国实验方剂学杂质，2011，17(17)：72.