铜胁迫对菹草无菌苗多胺及活性氧代谢的影响*1

姜 岩，施国新，陈 霖，汪鹏合，乔绪强，田秀丽

(南京师范大学生命科学学院，江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，南京210046)

Cu2+是植物生长发育必需的微量营养元素，但过量的Cu2+会对植物产生毒害［1-2］.Cu2+胁迫导致植物体内产生大量活性氧，对细胞膜、细胞结构等造成伤害，导致细胞代谢紊乱［3］.多胺是一类高生物活性的脂肪族含氮碱，能促进植物的生长发育，延迟衰老，提高植物的抗逆性等［4］.有研究表明，外源多胺可以缓解Cu2+胁迫对水鳖的毒害症状［5］，提高Cu2+胁迫下荇菜叶片生物膜的保护作用［6］，但关于内源多胺在植物体抵抗Cu2+胁迫方面的研究较少.目前研究中所采用的实验材料大多为自然生长的植物，取材受季节限制，实验结果易受植物生长环境的影响.鉴于此，本文以菹草无菌苗为实验材料，研究了Cu2+胁迫对菹草无菌苗的抗氧化酶活性、产生速率、H2O2含量、MDA含量及可溶性蛋白含量的影响，并研究了Cu2+胁迫对菹草无菌苗内源多胺代谢的影响，试图探讨菹草无菌苗内源多胺在Cu2+胁迫逆境适应中的变化及作用，并为进一步研究植物抗重金属胁迫的生理生化机制提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 实验材料

菹草(Potamogeton crispus L.)为眼子菜科植物，多年生沉水草本，根状茎细长，多分枝，侧枝短，叶呈披针形.本次实验所用菹草于2010年11月采自南京市琵琶湖水域，以菹草带节间的幼嫩茎段诱导产生的无菌苗作为研究对象.

1.2 研究方法

1.2.1 菹草无菌苗的培养 选取菹草靠近顶端的幼嫩茎段作为外植体，用清水冲洗干净，在无菌环境中依次经过5%的H2O2消毒15 min，无菌水冲洗3次;10%次氯酸钠消毒30s，无菌水冲洗5次后将菹草带侧芽的茎段剪成约8 mm长，接种于含6-BA(2.0 mg/L)和IBA(0.5 mg/L)的MS培养基中诱导芽分化;15 d左右茎间侧芽约2 cm长，转入含6-BA(2.0 mg/L)的MS继代培养基继代培养20 d;而后置于1/10的无菌Hoagland营养液中进行生根培养1个月以得到完整的无菌苗.整个组培过程在培养室进行，培养温度为25℃，每天光照16 h，光照强度为1200～1500 lx.

1.2.2 Cu2+对菹草无菌苗的毒害处理 选取生长状况一致的菹草无菌苗植株置于含0、1、2、4、8和12 μmol/L CuSO4(以纯Cu2+计)的无菌1/10 Hoagland营养液(Cu2+浓度为32 nmol/L)中，每个处理设3次重复，置于与培养无菌苗环境一致的培养室中培养.处理5 d后取菹草无菌苗完整植株，去离子水洗净、揩干，进行各项生理指标测定.

1.2.3 SOD、POD和CAT活性的测定 SOD活性测定采用NBT光化还原法［7］，以抑制NBT光还原50%所需的酶量为1个酶活性单位(U);POD活性测定采用愈创木酚方法［8］，以每分钟OD470的变化为1个酶活性单位(U);CAT活性测定采用钼酸盐方法［9］，以每分钟分解1 μmol H2O2所需的酶量为1个酶活性单位(U).

1.2.5 可溶性蛋白含量的测定 可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G-250法［12］测定，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白.

1.2.6 多胺含量及其代谢酶的测定 多胺含量的测定采用Aziz等［13］的方法，以nmol/g(FW)表示;精氨酸脱羧酶(ADC)和鸟氨酸脱羧酶(ODC)的活性根据Zhao等［14］的方法测定，其活性分别以1 μmol Agm/h和1 μmol Put/min为1个酶活性单位(U)表示;多胺氧化酶(PAO)和二胺氧化酶(DAO)的活性测定参照汪天等［15］的方法，以0.001ΔOD550/min 为 1 个酶活性单位(U).

1.3 统计分析

实验结果为3次重复的平均值±标准差，采用Excel和SPSS 17.0统计软件对实验数据进行制图和统计分析.用相关系数(r)对各指标与Cu2+浓度间进行相关性统计，P≥0.05表示无显著相关性，P＜0.05表示显著差异，P＜0.01表示极显著差异.

2 实验结果

2.1 Cu2+胁迫对菹草无菌苗SOD、POD、CAT活性的影响

随着Cu2+浓度升高，SOD活性明显被激活，表现为逐渐上升的趋势，在Cu2+浓度为12 μmol/L时最大，为对照的 1.92倍;POD和CAT活性随Cu2+浓度的升高均表现为先升后降，二者均在Cu2+浓度为1 μmol/L时达到峰值，分别为对照的3.97和2.52倍，后逐渐降低.相关性分析表明，SOD活性变化与Cu2+处理浓度间达到极显著正相关(r=0.9796，P ＜0.01)(图1).

图1 Cu2+胁迫对菹草无菌苗POD、SOD和CAT活性的影响(不同字母代表差异显著，下同)Fig.1 Effects of Cu2+stress on POD，SOD and CAT activities in aseptic seedlings of P.crispus

2.2 Cu2+胁迫对菹草无菌苗 产生速率、H2O2含量和MDA含量的影响

图2 Cu2+胁迫对菹草无菌苗产生速率(A)和H2O2、MDA含量(B)的影响Fig.2 Effects of Cu2+stress on generation rate(A)，H2O2and MDA contents(B)in aseptic seedlings of P.crispus

2.3 Cu2+胁迫对菹草无菌苗可溶性蛋白含量的影响

随着Cu2+浓度的升高，菹草无菌苗可溶性蛋白含量在短暂升高后迅速降低，在Cu2+浓度为12 μmol/L时最低，为对照的84.59%(图3).

2.4 Cu2+胁迫对菹草无菌苗多胺含量的影响

2.4.1 游离态多胺含量的变化 随着Cu2+浓度升高至2 μmol/L，菹草无菌苗游离态Put含量短暂上升至最大，为对照的1.45倍，后迅速降低;游离态Spd的含量则随Cu2+浓度的升高逐渐降低，当Cu2+浓度为12 μmol/L时，其含量仅为对照组的56.50%;游离态Spm的含量在Cu2+浓度为0～8 μmol/L时逐渐上升，在12 μmol/L时略有下降，但仍为对照组的1.46倍(图4A);游离态(Spd+Spm)/Put的比值在Cu2+浓度为0～2 μmol/L时有所降低，之后随着Cu2+浓度的升高迅速增大(图4B).相关性分析表明，游离态Spd的含量变化与Cu2+浓度之间呈极显著负相关(r=－0.8920，P ＜0.01).

图3 Cu2+胁迫对菹草无菌苗可溶性蛋白含量的影响Fig.3 Effect of Cu2+stress on soluble protein content in aseptic seedlings of P.crispus

2.4.2 结合态多胺含量的变化 菹草无菌苗的结合态Put含量在Cu2+浓度为0～2 μmol/L时缓慢上升并在2 μmol/L时达到峰值，为对照组的1.17倍，后其含量迅速下降并显著低于对照;随着Cu2+浓度升高，结合态Spd的含量与对照组相比有所上升;结合态Spm含量随Cu2+浓度的升高逐渐升高，当Cu2+浓度为8 μmol/L时含量达到最大值，为对照组的1.87倍(图4C).相关性分析表明，结合态Put含量变化与Cu2+处理浓度之间达到显著负相关(r= －0.8478，P＜0.05);结合态Spm含量变化与Cu2+处理浓度之间呈极显著正相关(r=0.9178，P ＜0.01).

2.4.3 束缚态多胺含量的变化 束缚态Put及Spd的含量均随Cu2+浓度升高逐渐升高，分别在Cu2+浓度为4 μmol/L和2 μmol/L时达到峰值，分别为对照组的5.59和1.78倍，之后二者含量均降低，但仍高于对照;束缚态Spm的含量随Cu2+浓度升高逐渐降低，当Cu2+浓度为12 μmol/L时，其含量仅为对照组的4.49%(图4D).

2.4.4 多胺总含量的变化 随着Cu2+浓度升高，Put总含量呈先升后降的趋势，在Cu2+浓度为2 μmol/L时达到最大值，为对照组的1.35倍，之后其含量迅速降低并低于对照;Spd的总含量随着Cu2+浓度的升高逐渐降低，当Cu2+浓度为12 μmol/L时，其含量最低，仅为对照组的68.03%;随Cu2+浓度升高，Spm的总含量逐渐上升，在Cu2+浓度为8 μmol/L时达到峰值，为对照组的1.78倍，之后略有降低.相关性分析表明，Spd总含量变化与Cu2+处理浓度之间达到极显著负相关(r=－0.8748，P＜0.01);Spm总含量变化与Cu2+处理浓度呈显著正相关(r=0.8039，P ＜0.05)(图4E).

2.5 Cu2+胁迫对菹草无菌苗ADC、ODC、PAO和DAO活性的影响

随着Cu2+浓度升高，ADC的活性表现为先升后降，在Cu2+浓度为1 μmol/L时活性最大，为对照组的1.18倍，后其活性逐渐降低并低于对照;ODC活性随着Cu2+浓度升高，变化不明显;PAO和DAO的活性随Cu2+浓度升高均表现为先升后降趋势，分别在Cu2+浓度为4 μmol/L和1 μmol/L时达到峰值，之后酶活性下降，但均高于对照(图5).相关性分析表明，PAO活性变化与Cu2+处理浓度呈显著正相关(r=0.7714，P ＜0.05).

3 讨论

图4 Cu2+胁迫对菹草无菌苗多胺含量的影响Fig.4 Effects of Cu2+stress on PAs content in aseptic seedlings of P.crispus

可溶性蛋白含量降低是植物重金属胁迫的特征之一，本研究结果显示，高浓度Cu2+胁迫导致菹草无菌苗可溶性蛋白含量迅速降低(图3).这主要是因为:(1)Cu2+进入细胞后促进蛋白水解酶的活性，加强原有蛋白质的分解［19］;(2)Cu2+对蛋白合成的众多酶系均有毒害和抑制作用，并且使蛋白质合成的相关细胞器受到损伤，抑制新蛋白的合成［20］.

多胺可以参与植物对逆境的响应，在清除活性氧自由基、维持生物膜稳定性等方面具有重要作用［21］.多胺的代谢特征之一是植物受到逆境胁迫时，体内多胺含量迅速发生变化，并且不同种类、不同形态的多胺可以相互转化［22］.多胺的氨基化程度越高，氨基数目越多，清除自由基的效果越好，因此三胺、四胺清除自由基的能力大于二胺，也就是说Spd和Spm清除自由基的能力要大于Put［23］.相关研究表明，游离态(Spd+Spm)/Put的升高有利于植物抵抗重金属胁迫［24］.本研究结果表明，在高浓度Cu2+胁迫时，游离态(Spd+Spm)/Put迅速增大(图4B)，这可能是因为游离态Put向Spd和Spm发生转化，对增强菹草无菌苗抵抗Cu2+胁迫有重要的作用.

图5 Cu2+胁迫对菹草无菌苗ADC、ODC(A)，PAO、DAO(B)活性的影响Fig.5 Effects of Cu2+stress on ADC，ODC(A)，PAO，DAO(B)activities in aseptic seedlings of P.crispus

研究表明，游离态多胺可以向结合态和束缚态多胺转化，结合态多胺能形成分子屏障、抵御外界不良因素的侵染，束缚态多胺则可通过大分子的交联稳定细胞内成分，结合态和束缚态多胺含量的增加可以增强植物抵抗胁迫的能力［25］.本研究结果显示，低浓度Cu2+胁迫时，结合态多胺含量均有所上升，可能是游离态多胺向结合态发生了转化，之后随着胁迫作用的加强，结合态Spd和Spm有所积累(图4C)，较高含量的结合态Spd和Spm有利于菹草无菌苗抵御Cu2+胁迫.在较低浓度Cu2+胁迫时，束缚态Put和Spd含量上升，随着Cu2+浓度进一步增大，束缚态Put含量迅速降低，而束缚态Spd含量变化平缓，可能是Put向Spd发生了转化，但二者含量仍高于对照(图4D).由于束缚态Put和Spd是束缚态多胺的主要成分，在胁迫期间，维持较高的束缚态Put和Spd含量，有利于稳定细胞结构［23，26］，提高菹草无菌苗的抗逆性.而束缚态Spm含量(图4D)随Cu2+浓度升高迅速降低，可能是向结合态发生了转化，也说明其对Cu2+胁迫比较敏感.

植物合成Put有两条途径，一是精氨酸(Arg)在ADC的作用下脱羧，生成鲱精胺(Agm)，再脱去一分子氨生成Put;二是精氨酸(Arg)先脱去一分子脲，生成鸟氨酸(Orn)，然后经ODC催化生成Put.汪沛洪［27］认为在渗透胁迫条件下，Put含量的上升是由于胁迫导致了ADC活性的上升，ODC则不参与反应.本实验中，处理后，在低浓度Cu2+胁迫时ADC活性受到激发，逐渐上升，之后随着Cu2+胁迫的进一步加深，其活性下降并低于对照，但ODC活性变化不明显(图5A)，说明Put的ADC生物合成途径与菹草无菌苗对Cu2+胁迫的反应有关.Put的降解酶DAO活性随Cu2+浓度升高表现与ADC相同，均为先升后降，但DAO活性均高于对照组(图5B)，可能是Put快速合成，并作为底物激活DAO，使其氧化活性增强，从而反馈调节Put.PAO是催化生物体内多胺降解的关键酶，其通过调节细胞内多胺的水平和生成物浓度，参与植物体对各种逆境胁迫的反应和生长发育过程［28］.本研究表明，随着Cu2+浓度升高，PAO活性逐渐升高，后有所降低但仍明显高于对照组(图5B)，这可能是因为Spm含量的升高诱导了PAO活性的同步升高，进而维持多胺代谢平衡.Spd在PAO的降解作用下，其含量随着Cu2+浓度的升高逐渐下降.而Spm含量升高可能是菹草无菌苗抵抗Cu2+胁迫的信号之一，是对胁迫伤害的一种适应性反应，提高了菹草无菌苗抗胁迫的能力.

综上所述，在Cu2+胁迫下，菹草无菌苗活性氧积累，膜脂过氧化程度增大，可溶性蛋白含量降低，表现出明显的氧化胁迫.在一定Cu2+胁迫浓度范围内，菹草无菌苗抗氧化酶活性的升高，Spm含量的增大，Put向Spd和Spm的转化以及不同状态多胺之间的转化，在一定程度上有利于降低活性氧对植物体的破坏，稳定细胞结构，提高菹草无菌苗抵抗Cu2+胁迫的能力.

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