2011年湖南省水稻矮缩病病原的RT-PCR检测和病害分级

徐志德，李 舒，刘建军，刘见平，刘都才，周国辉

（1.湖南省植物保护研究所，湖南 长沙410125；2.华南农业大学资源环境学院，广东 广州510642；3.常德市鼎城区农业局，湖南 常德415100）

由南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑条矮缩病是近年来南方地区新发生的一种重要水稻病害。该病暴发性强，扩展蔓延快，危害大，目前在湖南省普遍发生。2009年湖南省南方水稻黑条矮缩病发病面积达数万hm2，经济损失达数千万元。2009～2012年对湖南省的主要水稻栽培品种的抗病性、发病程度和症状类型等进行了全面调查和研究[1-3]。2010年湘南局部地区南方水稻黑条矮缩病发生严重，如江华瑶族自治县中稻发病面积9 333 hm2，平均病丛率达60%。根据病害发生规律，湖南省水稻可能受到多种病毒的侵染，近年SRBSDV、RRSV和RBSDV发生的可能性较大，这3种病毒引致的田间症状较为相似，田间调查时容易混淆。为明确上述3种病毒在湖南省的发生与分布情况，2011年在湘北、湘中和湘南各选1个县，采集了72个表现矮缩病症状的中晚稻病株样品，对其进行了SRBSDV（由白背飞虱传播）和水稻病原病毒水稻齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV，由褐飞虱传播）的RT-PCR检测，并对其中10个有代表性的样品进行了普通水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV，由灰飞虱传播）检测。

1 材料与方法

1.1 材料

2011年8～10月，从湖南省湘北的常德、湘中的长沙和湘南的永州共计采集了中晚稻水稻秧苗、植株、稻谷等72个表现矮缩病症状的病株样品，并根据症状表现对样品进行分类描述。

1.2 方法

1.2.1 总RNA抽提 取所采病害样品的叶片进行RNA抽提。每个样品取1 g左右，加入10粒直径2.5mm的玻璃珠和700μL Rnaiso Plus提取液，用Mini Bead Beater充分研磨1.5min；加氯仿500 μL剧烈振荡15 s，冰浴10 min，4℃、12 000 r/min离心15min；取其上清液再加氯仿500μL剧烈振荡15 s，冰浴10 min，4℃、12 000 r/min离心15 min；取其上清液加等体积的异丙醇约400μL轻微晃动，-20℃静置15 min，4℃、12 000 r/min离心15 min；弃其上清液，加80%DEPC乙醇1 mL，-20℃旋转混合；弃其上清液，再加无水乙醇1 mL，-20℃旋转混合；弃其上清液风干10 min，加100 μL DEPC ddH2O，轻弹溶解。将抽提得到的总RNA于-20℃保存。

1.2.2 RT-PCR检测 根据已报道的SRBSDV和RRSV基因组序列，分别设计了2对SRBSDV特异引物（S5-OF/S5-OR、S10-OF/S10-OR）用于该病毒的双重检测；1对RRSV特异引物（RRS8+/RRS8-）和1对RBSDV特异引物（RBSDV+/RBSDV-），用于相应病毒的检测（表1）。

表1 引物信息

一步法RT-PCR以稻株样品的总RNA为模板，采用TaKaRa公司的PrimeSprit One Step RTPCR KiT Ver.2试剂盒进行。其25μL反应体系含有12.5μL 2×Reaction buffer，1μL 10μmol/L上、下游引物，0.5μL 40 U/μL RTase，1μL总RNA模板，9μL RNase-free H2O。RT-PCR热循环条件为：50℃30min；94℃预变性2 min；94℃变性30 s，52℃复性30 s，72℃延伸1.5 min，35个循环；72℃延伸5 min。扩增完成后，取5μL RT-PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统中观察检测结果。对检测为阳性的样品，将其RT-PCR产物交由上海英骏生物技术公司进行纯化和直接测序，并对检测结果进行验证。

1.2.3 病害分级 2010年从大田中割取不同株高的水稻植株，在实验室仔细辨认植株病害症状后，再按株高分为无病株、有症状但矮缩不明显、有症状矮缩约1/4、有症状矮缩约1/3、有症状矮缩约1/2等5类，再详细考查株高、实粒数、空粒数和千粒重等性状。根据项数不相等成组数据的平均数t测验，对株高、实粒数和空粒数进行t测验，t测验不显著的植株再重新调整分组，直到3个性状的t测验全部达显著为止。

2 结果与分析

2.1 田间病害样品的症状观察

田间采集的矮缩病株症状有4种主要类型。（1）植株矮化、叶片皱缩、茎秆有蜡泪、有倒生气生根、有高位分蘖，这是典型病株症状。（2）植株矮化、叶片皱缩、茎秆有蜡泪、有倒生气生根、无高位分蘖。湘中长沙采集的矮缩病株该症状较多。（3）植株矮化、叶片皱缩、有高位分蘖、无倒生气生根、茎秆无蜡泪。湘北常德采集的矮缩病株该症状较多。（4）植株不矮化、叶片皱缩、有倒生气生根、有高位分蘖、茎秆无蜡泪。湘中长沙温室中采集的矮缩病株该症状较多。此外，还有只植株矮化；只有倒生气生根；植株矮化、有倒生气生根；叶片皱缩、有倒生气生根；叶片皱缩、有高位分蘖等几种症状类型，但数量不多。

2.2 RT-PCR检测

RT-PCR检测及产物测序结果表明，采集的72个样品中有14个（19.44%）含有SRBSDV（图1），此结果与张松柏的研究结果一致[4]。所有样品均未检出RRSV。另从未检出SRBSDV的样品中根据不同症状选取10个有代表性的样品进行RBSDV检测，亦未检出该病毒。

图1 部分样品的SRBSDV双重RT-PCR检测

72个检测样品中，表现出第1种症状的样品有14个，其中9个（64.3%）检出带毒；表现出第2种症状的样品有23个，其中3个（13.0%）检出带毒；表现出第3种症状的样品有2个，第4种症状的样品1个，均未检出带毒；表现其他类型症状的样品有19个，其中2个（10.5%）检出带毒；与典型病株同丛的健株样品13个，均没有检出病毒。

2.3 病害分级

如表2所示，在明确有无病害症状的基础上，采用株高和结实情况2个指标，可以很好地区分病害的不同危害程度。0级：没有任何病害症状，株高及结实正常，就属于正常植株；1级：至少有1种类型的病害症状，株高及结实情况约为正常植株的4/5；2级：有1种类型以上的病害症状，株高及结实情况约为正常植株的3/4；3级：有多种类型的病害症状，株高及结实情况约为正常植株的2/3；4级：有1种类型以上的病害症状，株高及结实情况不到正常植株的1/3。2011～2012年再次对病害的分级标准进行了验证，结果证明该病害分级能较好地符合病害实际发生危害的情况。

表2 南方水稻黑条矮缩病不同病级植株考查结果

3 讨论与结论

虽然湖南省每年褐飞虱都有大发生，2011年晚稻也危害严重[5]，但所检测样品都没有检测到齿叶矮缩病毒，这可能是由于迁飞迟、带毒率低等缘故。灰飞虱每年都有发生，且发生早，但对中晚稻的危害不重，故所检测的样品中也没有检测到普通水稻黑条矮缩病毒。白背飞虱在湖南省每年都有发生且与中晚稻秧田期和营养生长期吻合，故由白背飞虱传播的南方水稻黑条矮缩病毒的检出率较高，可能与当地南方水稻黑矮缩病毒的其他寄主植物较为丰富有关。

研究结果表明，南方水稻黑条矮缩病毒样品检出率占全部检测样品的比例为19.44%，占有病害症状样品的比例为23.73%，均属较低水平，与当年大面积发病情况较轻是一致的。茎秆有蜡泪症状的样品（第1、2种类型）病毒检出率较高，因此可以把样品是否具有蜡泪，作为判断南方水稻黑条矮缩病的一个典型症状。其他类型的样品虽然没有蜡泪，但能检测出病毒，其原因可能是因为病毒侵染较晚，症状表现（如蜡泪）还不充分，所以也不能忽视。而第3、4种类型样品，由于不具有蜡泪这个典型症状，没有检测出病毒，所以可以认为不是由南方水稻黑条矮缩病毒引起的。建议在对病害进行分级调查时，采用0～4级的分级标准。

[1]陈声祥，张巧艳.我国水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病研究进展[J].植物保护学报，2005，32（1）:97-103.

[2]徐志德.水稻黑条矮缩病在湖南普遍发生[J].湖南农业科学，2009，（10）:141.

[3]刘见平，徐志德，刘都才，等.湖南省南方水稻黑条矮缩病发病调查及其原因分析[J].杂交水稻，2012，27（4）：72-75.

[4]张松柏，张德咏，刘 勇，等.2009年造成湖南省水稻大面积矮缩的是南方水稻黑条矮缩病[J].植物保护，2010，36（4）:98-100.

[5]周国辉，张曙光，邹寿发，等.水稻新病害南方水稻黑条矮缩病发生特点及危害趋势分析[J].植物保护，2010，36（2）：144-146.