孑遗植物水松基因组DNA 提取及ISSR 反应体系建立

郑世群，刘金福，吴则焰，洪 伟，徐道炜，何中声

(1.福建农林大学林学院;2.福建农林大学生命科学学院，福建 福州350002)

水松(Glyptostrobus pensilis)属杉科水松属，是我国特有珍稀孑遗树种(国家一级保护植物).生长于沼泽地，耐水湿，是造船和造桥的良材;树根轻松、浮力大，可以用来做救生工具和木塞;枝叶和果实可入药［1］.水松在古生代曾广布于北半球，由于地史因素和人为活动影响，数量日益减少，已处于濒危状态，目前仅零星分布于我国南方.在研究杉科植物系统发育、古植物学和第四纪冰川气候等方面，水松具有重要科学价值，被世界保护监测中心列为稀有种，被《中国植物红皮书》列为濒危树种［2］.目前水松分布范围不断缩小且呈片段化，居群数量剧烈下降，大部分分布地仅剩几株孤立木，天然更新难以进行，幼苗幼树几乎没有，且病虫危害严重，加之人为干扰破坏，水松生存与繁殖面临严峻挑战.如何保护水松林稀有珍贵基因与种质资源、扩大水松林自然资源已成当务之急.

水松因其濒危状况受到众多学者高度关注.韩丽娟等［1-2］对水松生物学特性和保护、次生韧皮部解剖及其系统位置进行分析，斯缨等［3］研究水松叶总黄酮含量，李发根等［4］探讨了水松地理分布和濒危原因，郑世群等［5］针对濒危原因提出保护对策，吴则焰等［6-11］对水松种群生态学进行研究，但其分子生态学研究较少.简单重复序列间区(inter-simple sequence repeats，ISSR)分子标记技术具有快速、多态性高、稳定性和重复性好等优点［12］，已广泛用于植物遗传连锁图谱的构建、基因定位、种质资源鉴定、植物分类、进化和遗传多样性分析等方面［13］.作为基于PCR的一种分子标记，其扩增结果易受Mg2+、dNTP、DNA模板、Taq DNA聚合酶、引物等因素影响，DNA模板质量及稳定的PCR反应体系是获得可靠分子标记结果的前提［14］.根据Li et al［15］的ISSR反应体系重复试验，结果并不理想.考虑到反应体系会直接影响研究结果，本实验室拟研究获得高质量水松基因组DNA的方法，探讨建立适合于水松的ISSR-PCR反应体系，为水松分子标记和遗传多样性研究提供参考.

1 材料与方法

1.1 供试材料

实验材料于2008年12月至2009年3月采自于水松主要分布区福建屏南、三明、南平、福州、江西弋阳、广东斗门等地，共9个居群，合计100株.每个居群根据其分布情况随机选取代表性样株，每样株间隔距离至少5 m以上，将采集的每株幼嫩叶片装入自封袋中，用硅胶干燥保存，在实验室用液氮处理后，-40℃冷冻保存.

1.2 主要仪器和试剂

主要仪器:高速离心机(Beckman Avanti30 Centrifuge)，紫外分光光度计(WFZ800-D3B)，Thermo PCR(GebeAmpTM PCR Stystm 9700)，紫外凝胶成像系统(Gel Doc 2000TM).

主要试剂:dNTP、Buffer(10×PCR Buffer)、Marker D501A、Ex Taq DNA聚合酶购自宝生生物工程有限公司;随机引物和ISSR引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司;Tris、HCl、EDTA、CTAB、NaCl、β-巯基乙醇、硼酸、PVPP、乙醇、氯仿、异戊醇等均为国产分析纯试剂.

1.3 实验方法

1.3.1 水松基因组DNA提取 ①取0.5 g水松嫩叶放入液氮中研磨成粉，在研磨过程中，加入适量PVPP，转入1.5 mL 离心管中，加入800 μL 65 ℃的2 ×CTAB 提取液(100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，1.4 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA，2%CTAB)，另加入16 μL 5%β-巯基乙醇，充分混匀，放在65 ℃水浴保温30-60 min(每隔15 min摇匀1次);②加入600 μL氯仿—异戊醇(24∶1)，颠倒混匀，在12000 r·min-1离心5 min，将水相转入另一离心管;③重复第2步，即用氯仿-异戊醇(24∶1)再抽提一次;④在水相中加入1/5体积5 mol·L-1NaCl，再加入2/3体积冰冷的异丙醇，轻轻混匀后，置于-20℃ 30 min，然后10000 r·min-1离心5 min收集沉淀;⑤将沉淀用75%乙醇洗2次，在室温下自然风干4-10 min;⑥将此沉淀溶于合适体积(50-100 μL)0.1 × TE 缓冲液(1.0 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，0.1 mmol·L-1EDTA pH 8.0)，-20℃保存或4℃待用.

1.3.2 水松基因组DNA的检测 将提取的DNA样品适当稀释，在紫外分光光度计上测定D260nm和D280nm处的吸收值，计算DNA样品浓度.采用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统下拍照，检测DNA完整性和RNA消化情况.1.3.3 ISSR-PCR反应体系的正交优化 选用正交设计方案优化反应体系(表1).表中编号即正交试验设计的9个处理，以采自福州森林公园的水松DNA为模板，引物为811号(GAGAGAGAGAGAGAGAC)，反应总体积为20 μL，反应体系中含有2.0 μL 10 ×buffer缓冲液和相应体积的ddH2O［16-19］.

PCR反应所用程序为:94℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，循环35次，最后在72℃延伸10 min，4 ℃保存.

表1 ISSR-PCR体系的正交试验设计Table 1 Orthogonal design for ISSR-PCR

2 结果与分析

2.1 DNA 提取结果

经过提取与优化的水松基因组DNA呈米白色絮状和无色透明沉淀，电泳结果呈均一条带，说明提取的DNA较纯，基本去除了蛋白质、多糖和酚类等杂质(图1).水松基因组DNA的D260nm与D280nm的比值在1.75-1.85范围内，说明DNA纯度较高，符合要求.

2.2 ISSR反应体系确定

图2为正交试验扩增结果，由于Taq DNA聚合酶、引物、dNTP和DNA浓度不同，处理效果存在较大差异.

图2 ISSR-PCR正交试验扩增结果Fig.2 The orthogonal design results of ISSR-PCR

图1 DNA电泳检测图Fig.1 The result of genomic DNA gel electrophoresis

dNTP浓度过高会导致聚合酶的错误掺入，浓度过低又会影响合成效率，甚至会过早消耗而使产物单链化，影响扩增结果.在PCR反应中，dNTP浓度对扩增效果影响较明显，当dNTP浓度为0.18 mmol·L-1时，扩增条带较少，特异性也不强;当dNTP浓度为0.12 mmol·L-1时，扩增条带明显增多，且谱带很亮.故选择 dNTP 浓度为 0.12 mmol·L-1.

DNA模板含量是制约扩增产物得率及特异性的一个重要因子，模板含量过低，分子碰撞几率低，偶然性大，扩增产物无或不稳定;模板含量过高，又会相应增加非特异性产物的扩增.水松ISSR-PCR反应体系对DNA模板含量许可范围较大，30-50 ng·μL-1均可扩增出条带.因此，30 ng的模板DNA即可满足扩增需要.

在PCR反应中，Taq DNA聚合酶使用量也是影响实验的重要因素.高浓度Taq DNA聚合酶不仅成本高，且易产生非特异性扩增产物;Taq DNA聚合酶浓度过低会导致产物合成效率下降.由表1和图2可知，在20 μL反应体系中，使用2.0 U Taq DNA聚合酶扩增的条带最清晰，且数量最多，则选择的Taq DNA聚合酶的终浓度为2.0 U·μL-1.

在PCR反应中，引物浓度过低会导致扩增量不足，条带很少;浓度过高，会产生新的位点.即选择引物浓度为 0.12 umol·L-1.

在参考前人研究基础上［18］将Mg2+浓度定位于 2.0 mmol·L-1，Buffer用量定位于 2.0 μL.所以在20 μL的ISSR体系中，各反应成分用量见表2.

由实验结果可得，水松ISSR扩增最佳反应系:1×Buffer缓冲液，2.0 U Taq DNA 聚合酶，0.12 mmol·L-1dNTP，0.12 umol·L-1引物，DNA模板30 ng·μL-1，dd H2O 补足至体积为 20 μL.反应循环参数:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，循环 35 次，72℃延伸10 min，4℃保存.

2.3 ISSR-PCR的扩增结果

筛选出的10条ISSR引物对不同种源水松共扩增出95条谱带(表3)，其中多态性条带39条，多态性条带百分率为39.98%.平均每条引物扩增出9.5条谱带和3.9条多态性条带.引物873扩增出的条带最多(13条)，其多态性条带为54.0%;引物840扩增出的条带最少(7条)，多态性为28.57%.

表2 ISSR-PCR反应成分用量Table 2 Composition of reaction on ISSR-PCR

表3 筛选出的引物及其扩增结果Table 3 The sequence of 10 primers and amplified results

3 讨论

DNA模板质量直接影响DNA分子标记的分析结果.水松植物富含多酚和多糖，但不同发育时期存在较大差异，且居群间差异较大.因此，总结出一种普遍适用的基因组DNA提取方法较困难.运用改良CTAB法提取成年植株新鲜嫩叶的DNA，其DNA纯度高、质量好，可以直接用于DNA分子标记.

有关ISSR-PCR反应体系优化的报道较多，但大部分研究采用简单梯度试验方法对每个因素的最佳水平进行摸索，需进行多次梯度试验，试验过程繁琐，且不能兼顾到各因素间的交互作用，对试验结果判断缺少量化，缺乏一定标准.本实验采用的正交试验设计具有均衡分散、综合可比、效用明确的特点，确立了适合水松ISSR-PCR反应体系，试验结果的稳定性高、重复性好.

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［4］李发根，夏念和.水松地理分布及其濒危原因［J］.热带亚热带植物学报，2004，12(1):13-20.

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［6］吴则焰，刘金福，洪伟，等.孑遗植物屏南水松种群空间分布格局［J］.亚热带农业研究，2008，4(1):36-40.

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