维药新塔花中总黄酮纯化工艺研究

李国柱，张宇阳，孟庆艳*

（1.塔里木大学 生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护与利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

维药新塔花（Ziziphora clinopodioidesLam.）为唇形科（Lamiaceae）新塔花属（Ziziphora）植物，又名唇香草、小叶薄荷、山薄荷，在维吾尔语言中称之为苏则[1]。新塔花为多年生半灌木状草本植物，喜生长于低山坡草地以及干旱坡地，我国仅在新疆有分布，在蒙古和哈萨克斯坦等地区也有所分布[2]。芳香新塔花作为传统维吾尔药材，在新疆民间被广泛用于治疗高血压病、冠心病等心脑血管疾病[3-4]。全株地上部分均可入药，其味辛性寒，芳香具有疏散风热、清利头目、宁心安神、利水清热、壮骨强身、清胃消食之功能。主治感冒发热、目赤肿痛、头痛咽痛、心悸失眠等症[5-6]。现代研究表明，芳香新塔花主要含挥发油、萜类、生物碱、黄酮类等化学成分。其中的黄酮类化合物具有广泛的药理活性及营养保健作用[7-8]，研究芳香新塔花中总黄酮的纯化工艺对提高芳香新塔花植物的生物利用率有实际意义。

目前，对于维药芳香新塔花粗提物的研究，多在其提取方法上，而对于其最优纯化工艺的研究却不多。本实验通过对芳香新塔花纯化工艺的优化研究，得出新塔花纯化工艺，为以后新塔花属植物特色资源的利用提供参考。

冯云霞等[9-11]分别采用层析柱、树脂吸附法对黄芩和芝麻叶中的黄酮类化合物进行了纯化，但这些基本都未涉及树脂的筛选和工艺条件的优化以及各因素对树脂吸附解析的影响。大孔树脂预处理采用王慧彦等[12]在B-8大孔树脂对槐花总黄酮吸附性能研究中的方法。本实验使用XAD-7HP、X-5、AB-8、DM-130、D-101、HPD-600、HPD-300、HPD-20树脂吸附芳香新塔花提取液中的黄酮类物质，以树脂对芳香新塔花总黄酮的吸附量和解吸率为指标，考察了不同吸附浓度、吸附速度、吸附时间和乙醇浓度的影响，为更好地分离纯化新塔花总黄酮提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦丁标准品（纯度≥98%）：中国药品生物制品检定所；大孔树脂型号为型号为：XAD-7HP、X-5、AB-8、DM-130、D-101、HPD-600、HPD-300以及HPD-20：沧州恩宝化工有限公司；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为国产分析纯试剂。

芳香新塔花药材采自新疆昌吉州木垒县龙王庙水库，经鉴定为唇形科新塔花属植物（Z.clinopodioidesLam.）的干燥地上部分。

1.2 仪器与设备

Cary-100型紫外-可见光分光光度计：美国瓦里安公司；VIC-412型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；SB-2000恒温水浴锅、CA-1111冷却水循环装置：上海爱朗仪器厂；SK2200LH超声仪：上海科导超声仪器有限公司；旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司。

1.3 RE-5220方法

以总黄酮的吸附率和解吸率为指标，用8种不同的大孔树脂对芳香新塔花总黄酮进行静态吸附与解吸。筛选出8种大孔树脂中吸附量最大，解吸量最大的大孔树脂。在此基础上对总黄酮纯化的上样浓度，大孔树脂梯度洗脱，径高比，上样液流速的影响进行研究。

1.3.1 样品溶液的制备

总黄酮的提取：对200g芳香新塔花采用回流法，提取温度为80℃、乙醇浓度为75%vol、提取时间为65min、提取次数为2次、料液比为1∶20进行总黄酮的提取，提取液浓缩至黏稠状，烘干，备用。

标准曲线的绘制：采用AlCl3比色法[13-14]。精密称取芦丁标准品63.25mg于250mL容量瓶中，用70%vol乙醇定容至刻度，得到质量浓度为158μg/mL的标准品溶液。精密吸取对照品溶液0.00mL、1.50mL、3.00mL、4.50mL、6.00mL、7.50mL分别置于25mL容量瓶中，加入5%Na2NO20.75mL，摇匀，放置6min，加入10%Al（NO3）3溶液0.75mL，摇匀，放置6min，加入4%NaOH 10mL，加70%vol乙醇定容至刻度，摇匀，放置10min，于波长510nm处测定其吸光度值，（标准曲线测定方法）以浓度（X，μg/mL）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.0158X-0.0125，相关系数r=0.9993（n=9），结果表明，芦丁对照品溶液在0.53μg/mL～63.78μg/mL范围内呈良好的线性关系。

样品溶液的配制：精密称取0.94g芳香新塔花总黄酮，溶解于200mL水中，配制成溶液，备用。

1.3.2 大孔树脂的预处理

用95%vol乙醇将树脂浸泡24h，使其充分溶胀，95%vol乙醇湿法装柱，然后用95%vol乙醇以0.33mL/min通过树脂柱，流出液与少量蒸馏水（1∶5）混合后至无白色浑浊为止；再用蒸馏水以同样流速洗至无醇味；接着用5%HCl溶液以0.33mL/min通过树脂柱，并浸泡4h，用蒸馏水以同样流速洗至流出液的pH值呈中性；最后用2%NaOH溶液以0.33mL/min通过树脂柱，并浸泡4h，用蒸馏水以同样流速洗至流出液的pH值呈中性；浸泡于蒸馏水中，备用。

1.3.3 芳香新塔花中总黄酮对各种不同大孔树脂的吸附与解吸实验

静态吸附实验：称取经过预处理的8种不同的大孔树脂各2g，置于锥形瓶中，分别加入样品溶液30mL于锥形瓶中。每隔20min摇晃1次，摇晃2h，然后静置24h，按照“1.3.1”方法配制芦丁对照液，测量每个溶液的吸光度值，用以下公式计算其吸附量、解吸量、吸附率及解吸率。

式中：C0为样液中总黄酮初始质量浓度，mg/mL；C1为吸附后滤液中总黄酮质量浓度，mg/mL；V1为样液体积，mL；W为树脂湿质量，g；C2为解吸液中总黄酮质量浓度，mg/mL；V2为解吸液体积，mL。

静态解吸实验：将已经用总黄酮浸泡过的大孔树脂过滤，过滤出来的大孔树脂分别依次放入原来已经编号的锥形瓶中，各个锥形瓶中加入30mL、70%vol的溶液，浸泡，每隔20min摇动1次，连续2h，然后静置24h。按照“1.3.1”方法配制芦丁对照液。

1.3.4 进样质量浓度对大孔树脂影响因素的考察

称取6份经过预处理的大孔树脂各10g（干质量）湿法装于各层析柱（Φ1.5cm×40cm）中，量取6份质量浓度为9.20mg/mL的样液各20mL，分别加入0mL、20mL、40mL、60mL、80mL、100mL蒸馏水稀释，使样品尽可能混合均匀充分溶解。上柱，控制流速为0.5mL/min，测定流出液总黄酮含量，计算吸附量及吸附率，选择适宜的上样浓度。

1.3.5 大孔树脂的梯度洗脱

称取10g经过预处理的HPD-600大孔树脂湿法装柱于层析柱（Φ1.5cm×40cm）中。量取浓度为4.70mg/mL的供样液0.33mL/min上样，控制流速为0.5mL/min，分别用蒸馏水、30%vol乙醇溶液、50%vol乙醇溶液、70%vol乙醇溶液、90%vol乙醇溶液梯度洗脱，每种溶液流速分别为0.33mL/min，分别收集各种洗脱液，按照“1.3.1”方法，测定每种溶液的吸光度值，计算每种溶液的解吸量和解吸率。

1.3.6 径高比对大孔树脂吸附总黄酮影响因素的考察

称取4份处理好的HPD-600型大孔树脂湿法装柱于层析柱（Φ1.5cm×40cm）中，使4个层析柱中径高比分别为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10。分别在4个层析柱中加入样品溶液125mL、100mL、75mL、50mL，控制流速为0.33mL/min，按照“1.3.1”方法配制芦丁对照液，测定每种溶液的吸光度值，算出流出液的总黄酮含量，计算吸附率。

1.3.7 上样液流速对大孔树脂吸附总黄酮的影响因素的考察

用湿法装柱（Φ1.5cm×40cm），将等量称取的5份预处理好的大孔树脂HPD-600按照径高比为1∶10分别装在5个层析柱中，精密量取5份芦丁对照液100mL，分别控制上样液体流速为0.17mL/min、0.33mL/min、0.5mL/min、0.67mL/min、0.83mL/min，按照总黄酮标准曲线的测定方法配制溶液，测定吸光度值，计算每种溶液的吸附量。

1.3.8 大孔树脂动态吸附泄露曲线考察

将预处理好的HPD-600型号的大孔树脂用湿法装柱于层析柱（Φ1.5cm×40cm）中，加入芦丁对照液，上样液流速控制在0.5mL/min，径高比为1∶10，每0.17mL/min收集一次。共收集18份。测定每份洗脱液总黄酮含量。

1.3.9 树脂的强化再生方法

树脂使用一定的周期后，吸附能力会有所下降，尤其当被污染已经很严重的时候，吸附能力降低较大的时候需要强化再生。其方法是，在容器中加入高于树脂层10cm的2%～3%的盐酸溶液浸泡2h～4h，然后用盐酸溶液0.5mL/min过柱子，并用蒸馏水洗至中性；继续用5%的氢氧化钠溶液浸泡至2h～4h，并同时用同浓度的氢氧化钠溶液0.5mL/min过柱子，最后再用蒸馏水清洗至中性，再用乙醇0.33mL/min～0.5mL/min过柱子，然后用蒸馏水洗去乙醇，用蒸馏水浸泡备用[15]。也可以加入部分新树脂补充再生损耗或者新旧树脂套用。

2 结果与分析

2.1 对大孔树脂静态吸附与解吸测定结果

图1 各型大孔树脂对芳香新塔花总黄酮的吸附量与解吸量Fig.1 Adsorption and desorption capacity of different types of macroporous resins for total flavonoids from Ziziphora clinopodioidesLam

由图1可知，D-101型和DM-130虽然解吸率比较大，但是其吸附率不高。XAD-7HP、HPD-20、AB-8、HPD-300、X-5的吸附率和解吸率均不好。因此HPD-600型号的大孔树脂为这8种中的最佳选择。

2.2 进样质量浓度对HPD-600型大孔树脂吸附总黄酮的影响的结果

图2 进样质量浓度对HPD-600型大孔树脂吸附总黄酮的影响Fig.2 Effect of sample loading concentration on adsorption rates of HPD-600 macroporous resin for total flavonoids

由图2可知，进样质量浓度不能过大也不能过小，质量浓度过大或过小都不利于大孔树脂对芳香新塔花总黄酮的吸附，浓度过大，会造成总黄酮的浪费，使其吸收不完全；质量浓度过小，大孔树脂不能充分利用。因此，质量浓度为4.70mg/mL的进样液比较适宜。

2.3 洗脱液浓度考察结果

表1 洗脱液浓度考察Table 1 Determination of eluent concentration

由表1可知，总黄酮主要集中在30%vol、50%vol和70%vol的乙醇溶液中，因此，可以把30%vol、50%vol、70%vol的乙醇洗脱液合并利用。总黄酮分布于不同浓度的乙醇溶液中，原因是黄酮中带有不同的基团，因而极性不同，不同极性的黄酮由不同浓度的乙醇溶液洗脱而出，因而总黄酮分布于不同浓度的溶液中。

2.4 径高比对吸附量的影响结果

由图3可知，随着径高比的增加，大孔树脂吸附总黄酮能力也在增加。径高比为1∶10的时候，大孔树脂对总黄酮的吸附较好。因此，径高比确定为1∶10。

2.5 进样流率对HPD-600型大孔树脂吸附的影响结果

由图4可知，HPD-600型大孔树脂对总黄酮的吸附量随进样流速的增加也逐渐增加，当进样流速增加到一定程度时，吸附量反而会下降。因为当流速过大的时候，进样液和大孔树脂接触时间减少，吸附不够充分，吸附量也会随着进样流速的增加而降低，所以上样液的流速不能过大，也不能过小，因此，上样液流苏控制在0.5mL/min。

图3 径高比对吸附率的影响Fig.3 Effect of diameter height ratio on the adsorption rate

图4 进样流速对HPD-600型大孔树脂吸附的影响Fig.4 Effect of sample loading flow rate on adsorption of HPD-600 macroporous resin

2.6 HPD-600型大孔树脂动态吸附泄露曲线

图5 HPD-600型大孔树脂动态吸附泄露曲线Fig.5 Leakage curve for the dynamic adsorption of HPD-600 macroporous resin

由图5可知，开始洗脱时，洗脱液中的总黄酮含量是随着洗脱体积的增加而提高，当洗脱到第16份总黄酮流出液后，流出液的总黄酮含量增加趋于平稳，达到上样液的浓度，结果表明大孔树脂的吸附已经达到饱和。因此，最大的上样量为2.67mL/min。

3 结论

实验通过对8种不同型号的大孔树脂的吸附与解吸性能进行比较，结果表明，HPD-600型号的大孔树脂是最适用于纯化芳香新塔花总黄酮成分的树脂。同时采用HPD-600型号大孔树脂柱层析纯化芳香新塔花总黄酮最佳条件为上样液浓度为4.70mg/mL，径高比为1∶10，上样液流速为0.5mL/min，洗脱时合并30%vol、50%vol、70%vol的乙醇洗脱液。

研究可以发现，上样液体的浓度不宜过大，但是也不能过小。过大造成总黄酮溶解不充分，造成有效成分浪费，而且总黄酮会沉淀在大孔树脂上，降低树脂的使用寿命，流速也会越来越慢，得不到控制，对实验结果会有很大的影响。浓度过小，大孔树脂不能充分利用。在选用洗脱液浓度（乙醇浓度）的时候，乙醇浓度也不能过大，过大不能对吸附在大孔树脂上所吸附的总黄酮进行洗脱，并且对乙醇也会造成浪费。在上样流速的测定时，上样流速不能太快，流速太快，上样液和大孔树脂接触时间不够，大孔树脂对溶液中的芳香新塔花总黄酮吸附不够充分，吸附量也会随着流速的增加而降低。因此，也要控制好上样液的流速。

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