利用糖厂滤泥生产根瘤菌菌剂

刘 晓 举，陈 宝 娣，郭 继 强

(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034)

0 引 言

滤泥是甘蔗糖厂主要的废弃物，其中含有丰富的营养物质[1]，如糖分、蛋白质等，直接丢弃不仅污染环境而且浪费资源[2]。目前糖厂滤泥一般用于生产开发滤泥饲料、有机肥[3]。根瘤菌肥料在农业生产中扮演重要的角色，根瘤菌菌剂是含有根瘤菌的产品，在播种过程中可以接种在种子或者土壤中使用[4]。根瘤菌经过发酵培养之后转入固体粉末载体中，经过一段时间的增值和适应之后就形成了根瘤菌菌剂。实验室中常用的根瘤菌培养基耗费比较大，工业中用工业污泥代替培养基生产根瘤菌，含有充足营养成分的滤泥作为培养基便成了可能[5]。本研究以甘蔗糖厂滤泥作为培养基培养大豆根瘤菌，优化了培养条件，确定了固体滤泥可以作为菌体生长的载体，即制成根瘤菌菌剂。

1 实 验

1.1 材料与仪器

材料：甘蔗糖厂滤泥，广西大新县雷平永鑫糖业有限公司；大豆根瘤菌，分离自大豆根瘤，辽宁瓦房店农场提供；YMA培养基[6]，根瘤菌标准培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 糖厂滤泥成分测定

氮的测定：凯氏定氮法[7]。

糖的测定：3，5－二硝基水杨酸法[6]。

磷的测定：钼酸铵分光光度法[8]。

金属元素的测定：原子吸收光谱法[9]。

1.2.2 根瘤菌在不同湿度糖厂滤泥和YMA培养基中的生长曲线

以培养基中菌浊度为指标绘制根瘤菌的生长曲线[10]。

随着社会经济的不断发展，人们生活环境得到了很大改善，此时，建筑工程为了与这种情况相适应，基本建筑形式日渐复杂，人们对建筑要求也呈现出多样化趋势。为此，很多新型施工技术出现在了项目建设之中，电气接地施工技术便属于其中之一。施工单位在施工过程中，应该以施工质量为基础，在确保建筑安全的同时，避免群众生活受到影响。为了满足这一目标，建筑工程内部的接地工作同样显得十分重要。在该项技术的作用之下，建筑物在雷雨天气中的雷击率也会大幅下降。但该技术在使用之前也存在一些前提条件，需确保混凝土和钢筋建筑施工结构连接在一起，提升整体建筑的安全系数[1]。

1.2.3 糖厂滤泥培养根瘤菌条件优化

1.2.3.1 单因素实验

分别设计各因素梯度，其他条件不变，改变其中一个条件以分别考察总糖总氮比(mC∶mN)、温度、pH对大豆根瘤菌生长的影响。以滤泥中糖消耗量作为指标来表示生长量大小。各因素水平梯度分别为：mC∶mN，5∶2、10∶7、1∶1、7∶10、2∶5；培养温度，24、28、32、36、40 ℃；pH，6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；滤泥湿度，65.92%、72.97%、84.85%。分别确定大豆根瘤菌生长的最适条件[11]。

1.2.3.2 响应面分析

在单因素实验的基础上将滤泥湿度定为72.97%，以培养基滤泥糖消耗量(简称耗糖量)为指标，以培养温度(X1)、pH(X2)和培养基总糖总氮比(X3)为因素考察，分别选取3个水平进行响应面实验，每组实验作3个平行取平均值[12－14]。

2 结果与讨论

2.1 滤泥成分分析

2.1.1 总糖、总氮和总磷

滤泥中总氮、总糖、总磷质量分数分别为3.64%、12.46%、1.48%。实验表明，滤泥中含有足够根瘤菌生长的碳源和氮源，并且糖厂本身在生产中会有废糖蜜产出。废糖蜜中含有成分很高的糖，可以将废糖蜜加入滤泥中，这样在实际中较容易操作。

2.1.2 金属元素

从表1中可以看出，滤泥中含有足够多的微量元素。另外，用滤泥作为根瘤菌菌剂不用担心重金属污染的问题，因为豆科植物种子的接种量低，引入土壤中的重金属不足以污染环境。

表1 滤泥中金属元素的质量分数Tab.1 The metal element content of filter mud

2.2 根瘤菌在不同湿度滤泥中的生长曲线

由图1可知，供试菌在含水72.97%和含水84.85%的滤泥培养基中生长量较大。4个培养基中供试菌由对数生长期转入稳定生长期的时间均为18h左右。故可选择培养18h为测残糖时间节点。对2个优势培养基生长曲线比较分析，从开始的适应阶段到对数生长阶段2种培养基基本一致，菌体生长量为含水84.85%的培养基稍多，但是其物理性质接近液态。稳定期后的衰亡期则是含水72.97%的培养基衰亡较慢。故综合分析2种培养基，含水72.97%的培养基比较好，实际应用性强，所以单因素实验采用此培养基为基础进行优化。滤泥中的根瘤菌衰亡要比YMA培养基中的早，原因是滤泥中糖分不是很足，在实际操作中可以加入糖厂的废蜜来提高滤泥中的糖度[15]。

图1 供试菌培养基中的生长曲线Fig.1 The growth curve diagram of the bacteria in medium

2.3 滤泥培养根瘤菌条件优化及分析

2.3.1 单因素实验结果

总糖总氮比优化结果：由图2可知，总糖总氮比为7∶10时，耗糖量最大，生长量最大，而滤泥本身的总糖总氮比约为4∶1，所以在实际操作中适当加入一些含氮量高的物质会更好。

pH优化结果：由图3可见，在pH 7.5时耗糖量最大，生长量最大。这个在实际操作中很容易实现，因为滤泥本身就接近中性，所以稍加调整即可达到所要求条件。

温度优化结果：由图4可知，根瘤菌在滤泥中的最佳生长温度在29℃左右，这个环境与室温25℃差别不是很大，也较易实现，并且在室温条件下根瘤菌生长也较好，因此，在实际操作中很容易达到条件。2.3.2 响应面分析结果

以温度、总糖总氮比和pH为自变量，以耗糖量为因变量，用Design－Expert软件设计实验方案(表2)并对结果进行分析[15]，结果见表3。

以耗糖量为响应值，根据表3实验结果，利用Design－Expert软件进行模拟得二次回归方程R1＝0.350 800＋0.042 000X1＋0.042 875X2－0.037 708X3＋0.058 917X1X2＋0.011 250X1X3－0.015 333X2X3－0.044 983＋0.065 267－0.022 400。由此知X1(温度)、X2(pH)、X3(总糖总氮比)、X1X2(温度与pH的交互作用)对耗糖量的影响显著。表明实验因素对响应值不是简单的线性关系，二次项与响应值也有很大关系。

表2 Box－Behnken实验因素水平及编码表Tab.2 Box－Behnken coding schedule and the level of experimental factors

表3 Box－Behnken设计表及实验结果Tab.3 Box－Behnken design table and the experimental result

由表3和图5分析得出最大耗糖量的工艺条件组合：温度29℃，pH 7.5，总糖总氮比7∶10。为了检验所建模型的可行性，分别采用得到的最佳和最劣工艺条件进行验证实验，3次平行实验得到的最佳平均耗糖量为0.498，与理论值相差0.3%(相对误差1.7%)，效果显著。

图5 温度、总糖总氮比对耗糖量影响的响应面图Fig.5 The response surface of temperature，ratio of total sugar and nitrogen on the consumption of sugar

3 结 论

通过单因素实验和相应面分析确定了根瘤菌在滤泥中生长的最佳条件。

糖厂滤泥在菌剂生产中展示了良好的应用前景。虽然在可用性、前处理等方面还有待提高，但是它为可持续发展以及废物再利用找到了新的出路。滤泥作为培养基生产菌剂较标准培养基要节约成本，对滤泥稍加处理就可以利用，这种全新的方法用于大规模生产也有望成为现实。

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