HPLC法测定患者血浆中甲氨蝶呤的浓度

李文艳 彭梅

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一种二氢叶酸还原酶抑制剂，目前广泛用于治疗儿童淋巴性白血病、淋巴瘤和骨肉瘤等恶性肿瘤。甲氨蝶呤的体内药代动力学参数个体差异大，毒性大，监测其血药浓度有重要意义，为临床安全用药提供指导。目前测定甲氨蝶呤的方法主要有微生物法、荧光偏振免疫法、高效液相色谱法。笔者根据南昌市第一医院药剂科现有试验条件，建立高效液相色谱法测定血浆中甲氨蝶呤浓度，现报告如下。

1 仪器与试药

Agilent HPLC 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；；OpenLAB CDS ChemStation 化学工作站；Mettler-Toledo(FE20)pH计；TGL-16G高速离心机(上海)；甲氨蝶呤对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100138-201104)；甲醇为色谱纯；高氯酸、醋酸为分析纯；水为重蒸水。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×150 mm，5 μm)流动相：醋酸(pH=2.86)-甲醇(82.5：17.5)；流速：0.8 ml/min；柱温：40℃；检测波长 306nm。

2.2 对照品的配制 精密称了MTX对照品50.10 mg置50 ml溶量瓶中加磷酸缓冲盐定容至刻度，得1020μg/ml的对照储存液，置于4℃冰箱保存。使用时精密吸取适量对照液配制成所需浓度。

2.3 血浆样品的预处理 取血浆样品1 ml，分别置于5 ml离心管中，加入160 μl浓度为20%高氯酸液，沉淀血浆中的蛋白质，涡悬混匀1 min，高速度离心(10000 r/min)5 min．。取上清液0.6 ml置于2 ml离心管中，加入20 μl浓度为0.5 mol/L氢氧化钠溶液，涡悬混匀1 min，取30 μl进样，按外标法以峰面积计算样品含量。

2.4 专属性考察 在本实验条件下空白血清，MTX标准品血清样品，经高效液相色谱法测定，得到的色谱图，峰形尖锐且分离良好(R＞1.5)，血清中内源性成分对其测定均无干扰。MTX的保留时间为：10.18 min。高效液相色谱图见图1。

图1 血浆样品色谱图

2.5 线性关系考察 将对照液储存液用血浆按梯度稀释成10.20μg/ml，3.06μg/ml，1.02μg/ml，0.306μg/ml，0.102μg/ml，0.03μg/ml的标准血浆溶液，按“2.3”项处理，“2.1”项色谱条件测定峰面积。以MTX溶液的尝试对峰面积作线性回归(n=5)得回归方程：y=0.0146x+0.0004(浓度：0.03～1020μg/ml)，r=1。最低检测限 0.03μg/ml(S/N=3)，最低定量限：0.306μg/ml(S/N=10)

结果表明MTX在0.03～10.20μg/ml有良好的性线关系。最低检测限 0.03μg/ml(S/N=3)，最低定量限：0.306μg/ml(S/N=10)。

2.6 精密度试验 配制高中低不同浓度(0.306μg/ml，1.02μg/ml，3.06μg/ml)MTX 血浆各 3 份。按“2.3”项平行操作，得日内相对标准差(RSD)，连续测定3 d得平均日间相对标准差(RSD)(见表1)。高、中、低浓度的平均日内日间RSD均＜有5%。

2.7 回收率实验 取“2.6”项下3种浓度的标准血样各3份，按“2.3”项方法处理后进样分析，记录样品峰面积A1，用标准曲线计算出样品浓度，与加入的实际浓度比较，得本方法的回收率；同时取与各浓度标准血样相同标示量的水溶液直接进样，记录MTX峰面积A2，计算各浓度样品提取回收率：提取回收率=A1/A2×100%，结果见表1。

表1 MTX的日内、日间变异和回收率实验

3 讨论

本文参考有关文献在样品的处理和流动相的选择上进行优化［1-5］，选用高氯酸做蛋白沉淀剂，为提高回收率将其浓度提高到20%；在上清液中加入氢氧化钠调节pH值［3-4］保护色谱仪。有文献报道血清经高氯酸处理后，在MTX附近会出现杂峰，且无法与目标峰分离，建议在样本经处理后须在30 min内上机检测［1］，但本试验方法处理后的血浆样品性质稳定，并未影响实验结果。实验过程中发现药品用色谱柱Agilent ZorbaxSB-C18柱分离时峰形严重拖尾，换用不同流动相并不能改善拖尾现象，而改用Agilent Eclipse XDB-C18柱后峰形尖锐、无拖尾峰存在，流动相不用缓冲盐也能得到较好峰形。

本试验建立的HPLC法检测限低、保留时间适宜、线性范围广，重现性好。用于测定血浆中甲氨蝶呤的质量浓度，所需样本量少，色谱条件稳定，操作简单，成本低廉，可用于临床血药浓度监测和药物动力学的研究。

［1］ 许耕川，袁向亮，沈立松，等．HPLC法测定血清甲氨蝶呤浓度的方法建立及其与荧光偏振法的比较．检验医学，2010，25(9)：701-704.

［2］ 李惠芬，许俐．高效液相色谱法测定甲氨蝶呤血药浓度．天津医药，2003，31(7)：446-447.

［3］ 李碧峰，冯惠平，贾晋蓉，等．反相高效液相色谱法测定血浆中甲氨蝶呤的质量浓度．中国农业，2010，19(19)：7-8.

［4］ 唐丽红．HPLC法测定宫外孕患者血清中甲氨蝶呤的浓度．海峡药学．2003，1(1)：101-103.

［5］ 王印．治疗药物监测．北京：人民军医出版社，2011：220-224.