鼠胎膜修复大鼠腭裂的实验研究

张 驰，娜荷雅，张幸竹，王丝墨，唐喜乐，马振宇，肖 晶，李武伟

(大连医科大学口腔医学院，辽宁大连 116044)

鼠胎膜修复大鼠腭裂的实验研究

张 驰，娜荷雅，张幸竹，王丝墨，唐喜乐，马振宇，肖 晶，李武伟

(大连医科大学口腔医学院，辽宁大连 116044)

目的 以鼠胎膜对腭裂进行整复手术，研究修复腭裂的效果。方法 建立腭裂动物模型实验。30只SD大鼠按照腭部裂隙大小分为3组，每组10只。a组:长7 mm×宽0.9 mm;b组:长7 mm×宽1.1 mm;c组:长7 mm×宽1.3 mm。术后12周处死所有大鼠，观察裂隙变化。手术关闭裂隙实验。10只SD大鼠分为3组。A组大鼠5只，手术造腭裂并以新鲜双层胎膜关闭裂隙;B组大鼠3只，手术造腭裂，令裂隙自行生长;C组2只作为空白对照组。术后4周处死动物，大体观察;制作切片，行组织学观察。结果 腭裂动物模型成功建立，确立b组7 mm×1.1 mm为临界缺损。A组大鼠腭裂得到成功修复，口鼻腔黏膜分别愈合，完全覆盖腭裂，镜下见腭裂处口腔黏膜层次清楚，存在黏膜下层，顶部有完整的鼻腔黏膜。结论 鼠胎膜对SD大鼠腭裂具有良好的修复效果。

腭裂;动物模型;腭裂整复术;胎膜;大鼠

先天性腭裂是口腔颌面外科常见的发育畸形。由于腭部组织缺损导致口鼻腔相通，引起发音、吮吸、吞咽等功能障碍;同时，腭裂还影响颌骨的生长发育，常导致面中部塌陷和咬合关系错乱［1］。近百年来，腭裂的整复治疗主要是采用手术的方法，利用裂隙邻近的黏骨膜组织瓣封闭裂隙，达到隔离口鼻腔的目的。但是，有时难以克服手术后创口裂开和瘢痕影响腭骨的生长发育等并发症。因此，选用更好的方法对腭裂进行修复一直是研究的关注点。本研究使用同种异体鼠胎膜对大鼠手术造模腭裂进行了关闭裂隙的实验，观察其修复效果，以此为临床腭裂患儿利用人羊膜进行整复治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

采用4周大SD雌性大鼠，由大连医科大学动物实验中心提供。体重120～150 g，共40只。随机分为2组:(1)腭裂动物模型组:大鼠30只，按照不同造模裂隙大小分为3组，每组10只。a组:长7 mm × 宽0.9 mm;b组:长7 mm × 宽1.1 mm;c组:长7 mm×宽1.3 mm。(2)手术关闭裂隙组:大鼠10只，分为3组。A组:大鼠5只，手术造裂并关闭裂隙;B组:大鼠3只，手术造裂，令裂隙自行生长;C组:大鼠2只，空白对照组，不行任何手术。另备1只预产期为2～3 d后的SD孕鼠。

1.2 实验器械和药品

2.5%戊巴比妥钠，1%和3%碘酊，PBS液，开口器，缝合线(4-0，8-0)，牙科台式电机和慢速钻，真空压模成型器(日本)，透明成形塑料板等。

1.3 腭裂动物模型实验

2.5%戊巴比妥钠按20～30 mg/kg行大鼠腹腔内麻醉，常规备皮，3%碘酊消毒。固定大鼠于手术台上，开口器撑开口腔，1%碘酊消毒口腔。腭骨后缘起始，于腭部正中处由后向前做长7 mm，宽分别为0.9 mm、1.1 mm 和 1.3 mm 的长方形黏骨膜切口，用牙科台式电机和慢速钻在相应范围内形成骨缺损［2-3］。生理盐水加庆大霉素冲洗创面，压迫止血。术后动物自由活动，每日肌注青霉素80万单位，连续3 d。12周后处死3组所有大鼠，取腭部样本，观察裂隙的变化。

1.4 手术关闭裂隙实验

1.4.1 大鼠胎膜制备:将孕鼠如前麻醉固定后，腹部备皮常规消毒，切开暴露腹腔，剪开子宫，摘除多个胚胎，剪取胎膜，PBS反复冲洗 3次，裁减成9 mm ×2.2 mm、9 mm ×2.6 mm、9 mm ×3.0 mm 大小的胎膜，置于庆大霉素生理盐水中备用。

1.4.2 大鼠腭护板制备:术前以硅橡胶取大鼠腭部阴模灌注超硬石膏，以压模成型器和透明成形塑料板制作腭护板，四角打孔后备用。

1.4.3 腭裂整复术:A、B组大鼠如前准备和手术造裂，裂隙长7 mm×宽1.1 mm(图1)。将裁减好的胎膜折叠成双层，胚胎面朝外，8-0丝线无张力缝合固定于A组大鼠裂隙两侧口腔黏骨膜(图2)。其上覆盖腭护板，4-0丝线缝合亦固定于两侧黏骨膜上。B组大鼠仅造裂，C组大鼠不做处置。

术后如前护理，每日观察大鼠的活动情况，至术后第7日时拆除A组大鼠腭护板。术后4周处死所有大鼠，腭部取材。10%中性福尔马林固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明处理，常规石蜡包埋。苏木精-伊红(HE)染色，中性胶封片，光镜下观察。

2 结 果

2.1 腭裂动物模型建立

全部大鼠成活，术后12周时3组大鼠的裂隙出现了不同的变化。a组裂隙长度、宽度变小，两侧黏骨膜向裂隙中央生长，未完全融合。去除黏骨膜后见骨板在裂隙前后两端出现少量骨桥生长。b组裂隙黏骨膜未向中央生长，裂隙长度基本不变，宽度增加，裂隙前后两端未见骨桥生长。c组裂隙存在，长度及宽度均明显增加。采用Fisher四格表确切概率法对结果进行统计学分析，确定b组裂隙可以在术后12周时保持稳定的裂隙宽度，符合实验要求，为本研究的临界缺损。见表1。

2.2 手术关闭裂隙组大体观察

全部大鼠成活，未发现明显排异反应。术后4周时，A组大鼠裂隙被口鼻腔黏膜完全覆盖，未见移植胎膜。裂隙中央表面黏膜略凹陷，光滑、完整，质地与周围黏膜一致，颜色略暗(图3)。B组大鼠见裂隙存在，裂隙两端骨板被口鼻腔黏膜融合生长后覆盖。C组大鼠腭部黏膜完整、光滑，表现正常。

表1 术后12周时不同组别裂隙宽度的变化Tab 1 At the end of postoperative 12 weeks，the changes of cleft width in different groups

图3 术后4周A组大体表现Fig 3 At 4 weeks，the gross appearance of group A

2.3 手术关闭裂隙组组织学观察

A组大鼠腭部黏膜连续、完整，完全覆盖裂隙，黏膜下层是较致密的胶原层，上方覆盖鼻腔黏膜。口腔黏膜上皮层次清晰，细胞成熟，形态正常。上皮钉突明显，排列整齐均匀。与两侧正常黏膜上皮形态基本一致(图4)。

图4 术后4周，A组腭部黏膜完全覆盖裂隙(HE×100)Fig 4 At 4 weeks，the cleft was completely covered with normal mucosa in group A

B组大鼠腭部裂隙存在，口腔黏膜中断，与鼻腔黏膜融合生长。口鼻腔黏膜上皮层次清晰，细胞成熟，形态正常(图5)。C组大鼠腭部为正常表现，口鼻腔黏膜之间可见黏膜下层和完整的骨板(图6)。A组与C组的口鼻腔黏膜组织学表现基本一致。

3 讨 论

先天性唇腭裂动物模型的建立耗时、费用高，胚胎易发生流产不易存活，而且存在新生的腭裂动物喂养困难，形成的裂隙大小和解剖可变性大等诸多因素，因此选择具有同一标准的先天性唇腭裂动物应用于实验研究面临很大困难。迄今为止，尚未见到先天性唇腭裂动物模型用于整复研究的报道。

与先天性唇腭裂动物模型相比较，外科手术诱导的唇腭裂动物模型具有较高的一致性、可重复性和可适用性。因此，采用外科手术建立唇腭裂动物模型是一种既简便又经济的方法，具有稳定性好、数量可控、获得时间短等明显优点，现已广泛应用于各种唇腭裂修补术式和颌面发育等方面的研究［4-5］。本研究选择了外科手术诱导的腭裂动物模型用于整复效果的研究，获得了理想的结果。

临界缺损(critical-sized defect)是指动物依靠自身修复不能恢复的最小缺损［6-7］。建立临界缺损动物模型是研究组织缺损修复的前提条件。本组采用外科手术法获得了腭部软硬组织共同缺损的临界缺损值，成功建立了腭裂动物模型。本研究确立的腭部临界缺损可以应用于今后的腭裂动物实验研究中，如果想要进一步了解整复的效果，以增加腭部裂隙的宽度为宜。

利用裂隙旁黏骨膜瓣修补腭裂的外科手术一直是临床治疗的主要方法。但是，传统的手术方法有许多缺陷:手术创伤大，分离裂隙旁的黏骨膜会破坏腭骨的血运，术后瘢痕影响腭骨的后天发育，从而影响颌面的整体发育;手术年龄一般在2岁左右，会影响患儿早期语音训练;裂隙较大时术后可能出现瘘或复裂。因此，本研究采用具有良好组织相容性的组织膜片来修复腭裂，避免了传统手术方法的不足，获得了稳定、准确的关闭裂隙的效果。近年来，新型生物材料被广泛应用于临床治疗中，为改进传统腭裂手术提供了新希望［8-9］。本研究借鉴羊膜修复眼角膜溃疡的成功经验，利用SD大鼠胎膜修复同种异体大鼠腭裂组织缺损，来探索一条治疗腭裂的新路径，为临床修复人类腭裂提供实验依据。鼠胎膜修复腭裂的研究，目前国内外没有报道。胎膜包含绒毛膜和羊膜，其中羊膜具有独特的生物学特性:(1)抗炎、抗纤维化、抗新生血管作用:羊膜细胞能分泌多种抗体、多种溶菌酶、裂解体和补体，具有抗病毒和杀菌作用，从而抑制局部炎症反应，阻止新生血管和疤痕形成;(2)羊膜能分泌多种细胞因子，在伤口愈合中起重要作用——羊膜没有免疫原性、含有多种有益生长因子，能够促进创口的愈合，是天然的、良好的组织缺损修复材料。本实验中未观察到关闭裂隙A组动物出现明显排异反应，全部大鼠腭部均获得完全愈合，组织学观察口鼻腔黏膜形态、结构与正常大鼠腭部组织结构相似。而B组未能关闭裂隙，说明同种异体胎膜修复大鼠腭裂的手术是成功的。

本实验结果提示，在人类腭裂的治疗中也可以采用相似的方法。利用人羊膜来修复关闭裂隙也可获得同样满意的效果［10-11］。如此则将改变目前临床腭裂治疗的许多限制，拓宽适应症的范围;同时，较小的手术创伤对颌面骨的发育将减少到最小，可以降低后天畸形的发生率。

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Experimental study on cleft palate repair of rat using rat fetal membrane

ZHANG Chi，NA He-ya，ZHANG Xing-zhu，WANG Si-mo，TANG Xi-le，MA Zhen-yu，XIAO Jing，LI Wu-wei
(College of Stomatology，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObjectiveTo explore the feasibility of repairing the defect in cleft palate using fetal membrane in a rat model.MethodsTo establish the animal model of cleft palate.Thirty SD rats were randomly divided into three groups with 10 rats in each group according to the different size of man-made cleft，group a:7 mm ×0.9 mm，group b:7 mm ×1.1 mm，group c:7 mm ×1.3 mm.Animals were sacrificed at the end of 12 weeks and the changes of clefts were compared.Repairing experiment for cleft palate.Ten SD rats were randomly divided into three groups，group A was underwent reduction with 5 rats，group B was only performed model operation with 3 rats，group C was blank with 2 rats.All rats were sacrificed at the end of 4 weeks and the gross and histological observation was respectively carried out.ResultsThe animal model of cleft palate was successfully established.Group b was determined to be the animal model group for critical-sized defect.Cleft palate was repaired successfully in group A with fetal membrane of rat，the structure of palate mucosa was similar to that of the group C in gross and histology.ConclusionThe tissue defect of cleft palate in a rat model can be repaired with rat fetal membrane，which is valuable for repairing human cleft palate in future.

［Key words］cleft palate;animal model;cleft palate repair;fetal membrane;rat

R656.21

A

1671-7295(2013)02-0135-04

张驰，娜荷雅，张幸竹，等.鼠胎膜修复大鼠腭裂的实验研究［J］.大连医科大学学报，2013，35(2):135-138.

10.11724/jdmu.2013.02.09

大连医科大学第六届大学生课外学术科技作品大赛立项(2012年6月)

张 驰(1989-)，女，贵州安顺人，本科学生。

李武伟，副教授。E-mail:liwuweihong@yahoo.com.cn

2012-12-15;

2013-03-11)