金花茶花、种子和叶提取物对U937和HCT116细胞增殖抑制的实验观察

于大永， 时贞颂， 史丽颖， 冯宝民， 王永奇

(大连大学药物研究所，辽宁大连116622)

金花茶Camellia chrysantha(Hu)Tuyama系山茶科Theaceae山茶属Camellia植物，集中分布在中国广西壮族自治区的西南部以及广西壮族自治区与越南接壤的区域［1］。金花茶的叶主要用于咽喉炎，痢疾，肾炎，水肿，尿路感染，黄疸性肝炎，肝硬化腹水，高血压，预防肿瘤等。金花茶花主要用于便血、月经不调［2-3］。早期金花茶研究热点主要集中在对金花茶植物形态学、植物分类学等方面的报道。而近年来对金花茶活性及功能因子的研究表明，金花茶具有抗氧化、降血脂、抗肝癌前病变等活性［4-6］。本课题组在以前的研究中报道了金花茶种子可以抑制肿瘤细胞增殖［7］，现在继续对金花茶植物各部位抗肿瘤活性进行研究。

1 材料和方法

1.1 金花茶种子的提取 金花茶种子、花和叶采集于广西南宁，由广西林业科学研究院高级工程师梁盛业鉴定。金花茶种子、花和叶用95%乙醇提取并浓缩，得到金花茶种子95%乙醇提取物、叶95%乙醇提取物和花95%乙醇提取物。金花茶叶用蒸馏水提取并浓缩，得到金花茶叶水提取物。实验前将上述各浸膏用DMSO分别配成质量浓度为100 mg/mL的样品。然后将各个样品用无血清培养基配成50、100、200、500、1 000、2 000μg/mL的药物原液，并用0.22μm微孔滤膜过滤，置4℃冰箱备用。

1.2 细胞培养 人单核细胞白血病细胞株U937和人结肠癌细胞HCT116，常规传代培养。培养液用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，同时加入链霉素和青霉素，使双抗在培养液中的浓度为100 U/mL，于37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养。视具体情况换培养液，每2～3天传代培养，使细胞保持在对数生长期。

1.3 体外细胞增殖抑制实验 选择生长状态较好，处于对数期的细胞，用含有10%热灭活小牛血清的RPMI 1640培养液将U937和HCT116细胞制成悬液并调密度至1×105/m L，取96孔平底培养板，各孔加入180μL细胞悬液。细胞贴壁后，分别加入不同质量浓度的药物原液20 μL，实验组设6个药物质量浓度组，每组药物的终质量浓度分别为5、10、20、50、100、200μg/mL。其中药物质量浓度为200μg/mL时含二甲基亚砜 (DMSO)量最高，为0.2%，因此设空白对照和含0.2%DMSO对照。每个样品重复3孔。将培养板移入CO2孵箱中，孵育24 h，各孔加入MTT溶液 (5 mg/mL)20μL，同样条件继续孵育4 h终止培养。弃上清液，每孔加入150μL DMSO，(40℃恒温培养箱中放置使结晶物充分溶解)。选择570 nm波长，在酶标仪上测定各孔OD值，计算体外细胞存活率。细胞存活率=(药物孔OD值/对照孔OD值) ×100%。

1.4 统计分析 实验重复3次，实验结果以均值±标准差表示，采用统计学t检验进行组间比较分析，P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 金花茶花的抗肿瘤活性 用金花茶花95%乙醇提取物处理HCT116细胞和U937细胞，结果 (表1)发现20 μg/mL金花茶花乙醇提取物对HCT116细胞增殖就开始有抑制作用，并且随着样品质量浓度的增加，细胞存活率逐步下降提高，且与对照组有显著差异 (P＜0.05或P＜0.01)。金花茶花乙醇提取物从50μg/mL开始对U937细胞增殖有抑制作用，并且也表现出剂量依赖性关系。另外含0.2%的DMSO的样品与空白对照相比没有差异 (数据未列出)。经过计算金花茶花95%乙醇提取物抑制HCT116和U937细胞的IC50分别为48.48μg/mL和211.71μg/mL。

表1 金花茶花95%乙醇提取物对U937细胞和HCT116细胞增殖的影响

2.2 金花茶种子的抗肿瘤活性 考察了不同质量浓度金花茶种子95%乙醇提取物对U937和HCT116细胞增殖的影响。从表2可以看到5μg/mL金花茶种子乙醇提取物对U937就开始有抑制作用，并且随着质量浓度增大呈现出剂量效应关系，各质量浓度组与对照组比较，有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。而金花茶种子乙醇提取物抑制HCT116细胞增殖的质量浓度范围为50～200μg/mL，与对照相比有显著性差异 (P＜0.05或P＜0.01)。金花茶种子95%乙醇提取物抑制U937和HCT116细胞增殖的IC50分别为37.48μg/mL和94.17μg/mL。

表2 金花茶种子95%乙醇提取物对U937细胞和HCT116细胞增殖的影响

2.3 金花茶叶子的抗肿瘤活性 对金花茶叶乙醇提取物和水提取抑制肿瘤细胞增殖的活性进行了评价。从结果中发现金花茶叶不同提取物都有很强的抑制U937细胞增殖的作用 (表3)。其中叶乙醇提取物抑制U937细胞增殖的质量浓度范围为20～200μg/mL，水提取的抑制质量浓度范围为50～200μg/mL，并且细胞存活率随样品质量浓度的加大而降低 (与对照组相比，P＜0.05或P＜0.01)。金花茶叶乙醇提取物和水提取抑制U937细胞增殖的IC50分别为149.19 μg/mL和162.96μg/mL。而金花茶叶子的不同提取物对HCT116细胞增殖影响很小，结果表明没有统计学意义。

表3 金花茶叶不同提取物对U937细胞和HCT116细胞增殖的影响

3 讨论

本研究旨在探讨金花茶不同植物部位对人白血病和结肠癌细胞株的抑制作用。在以前的研究中，金花茶叶是主要的药用部位，富含氨基酸、茶皂苷、黄酮类及多种微量元素［8-9］。具有降血脂、降压和抗癌防癌等方面的功能［5，10-12］。为此，本实验对金花茶不同植物部位抑制肿瘤细胞的活性进行了考察。在研究中发现金花茶花抑制HCT116和U937细胞的IC50分别为48.48μg/m L和211.71 μg/mL，金花茶花抑制人结肠癌细胞的作用更为明显。金花茶种子显示了较强的抑制U937和HCT116细胞增殖的活性，其IC50分别为37.48μg/mL和94.17μg/mL，金花茶种子抑制U937细胞增殖作用更为明显。而金花茶叶子不同提取物对U937细胞增殖有明显的抑制作用，但是对HCT116细胞增殖抑制作用不明显。本研究表明，金花茶花、种子和叶子均有抑制肿瘤细胞增殖的作用，在不同的肿瘤细胞中表现不同。而且与传统的金花茶叶作为药用部位相比，其花和种子有着更为显著地抑制肿瘤细胞的作用。这些发现为金花茶抗肿瘤研究奠定了理论基础，同时为该植物资源开发利用提供了理论依据。

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