HPLC法同时测定合欢花中3种黄酮类成分

王 萌， 郭伟英

(辽宁医学院药学院，辽宁锦州121000)

合欢花为豆科植物合欢Albizzia julibrissin Durazz的干燥花序，为常用中药，合欢花具解郁安神之功效，常用于心神不安，忧郁失眠［1］。现代药理实验研究表明，合欢花的水煎液［2］及其所含的槲皮苷、异槲皮苷均有较强的镇静催眠作用［3］;合欢花水提物对“行为绝望”动物模型有明显抗抑郁作用［4］。其主要化学成分为槲皮苷、槲皮素、异槲皮苷、芦丁、山柰酚和异鼠李素等黄酮类化合物［5-7］。《中国药典》2010年版只对合欢花中的槲皮苷成分进行了定量测定，在目前已有的文献报道中，有人采用紫外分光光度法测定合欢花中总黄酮的量［8］、RP-HPLC 测定合欢花中槲皮苷的量［9-12］及HPLC测定合欢花中槲皮素的量［13］，但未见同时测定合欢花中异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素3种黄酮类的报道。本实验采用RP-HPLC法同时测定了合欢花中异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素的量，以期为合欢花的质量控制提供一定依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 日立 L—2000系列高效液相色谱仪(日本高新技术集团);AL—204型精密电子天平［梅特勒-托利多 (上海)有限公司］;KQ—100A型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);pHS—3C型酸度计 (上海伟业仪器厂)。

1.2 试剂 异槲皮苷对照品 (批号11121801，纯度≥98%)、槲皮苷对照品 (批号11122102，纯度≥98%)及槲皮素对照品 (批号12072505，纯度为98.13%)均为成都曼斯特生物科技有限公司提供;合欢花分别购自8个地区某药房 (吉林长春20120730;吉林永吉 20120813;辽宁锦州20120901;辽宁大连 20120830;河北廊坊20120808;河北保定 20120815;陕西西安20121101;陕西榆林20121019)，药材均由辽宁医学院药学院郭伟英教授鉴定实为豆科植物合欢Albizzia julibrissin Durazz的干燥花序;甲醇、磷酸为色谱纯，乙醇为分析纯，水为自制三蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil BDS色谱柱 (200 mm×4.6 mm，5μm)，大连依利特科学仪器有限公司;流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液 (34∶66);体积流量1.0 mL/min;检测波长360 nm;柱温35℃;进样量10μL。按上述色谱条件下，异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素与样品中其他成分均能达到完全分离，分离度均大于1.5，理论塔板数均不小于3 000。见图1。

图1 对照品 (A)、供试品溶液 (B)的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sam ple solution(B)

2.2 混合对照品溶液的配制 分别精密称取对照品异槲皮苷8.9 mg，槲皮苷15.15 mg，槲皮素6.6 mg于25 mL量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，配成质量浓度分别为0.356、0.606、0.264 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的配制 精密称取合欢花粉末(辽宁锦州)2.0 g，至具塞锥形瓶中，加90%乙醇40 mL溶解，称定质量，超声处理40 min，放冷后用90%乙醇补足质量，摇匀，用滤纸滤去残渣，取上清液，即得合欢花药材供试品溶液。进样前，用0.45μm微孔滤膜过滤。

2.4 线性关系考察 取混合对照品溶液0.2、0.5、2.5、5、7.5 mL，分别置10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀。分别精密吸取各混合溶液及原混合溶液10μL进样分析，以各成分质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素的回归方程及相关系数分别为:Y=1.31×107X+6.97×103，r=0.999 8(n=6);Y=1.39×107X+4.15×103，r=0.999 8(n=6);Y=1.16×107X－2.87×104，r=0.999 7(n=6)。线性范围分别为7.12～356 μg/mL、12.12～606 μg/mL、5.28～264μg/mL。

2.5 精密度试验 精密吸取2.2项下的混合对照品溶液10μL，连续重复进样6次，得到异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面积的RSD(n=6)分别为0.86%、0.70%、0.90%。结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液进样10 μL，分别于0、4、8、12、24 h进样分析，测得异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面积的RSD(n=5)分别为1.21%、0.94%、1.80%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一批样品 (辽宁锦州)6份，精密称定，按2.3项下的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样，进样量为10μL，得到异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素的含有量平均值分别为 0.755 mg/g、8.537 mg/g、0.191 mg/g，RSD(n=6)分别为1.11%、0.83%、1.42%。表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称定已知含有量的合欢花粉末 (辽宁锦州)约1.0 g，共9份，每3份为一组，每组分别精密加入异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素对照品溶液适量，制成低、中、高质量浓度的溶液，按2.3项下的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，进样量为10μL。计算加样回收率和RSD，见表1。结果异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素平均回收率 (n=9)为96.2%、100.1%、96.7%。

2.9 样品测定 购自8个不同产地的合欢花药材，分别按2.3项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，每份溶液进样3次，按外标法计算异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素的量，结果见表2。

表2 样品测定结果 (n=3)Tab.2 Results of content determination of sam p les(n=3)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择 根据待测组分化学性质上的特点［14］，曾采用70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、80%甲醇对合欢花进行提取，结果90%乙醇提取所制备的供试品溶液干扰成分少，各主成分峰分离较理想;曾对超声提取法和加热回流法进行考察，对于含有量较高的槲皮苷和异槲皮苷，超声提取效果稍差，对于含有量较低的槲皮素，两者没有显著差别，而超声提取法简单省时、安全且易于平行获取供试品溶液;也曾对超声时间(40 min、60 min、90 min)，溶剂用量 (40 mL、50 mL、60 mL)进行考察，区别不大。最终结果为用90%乙醇40 mL超声40 min制备的合欢花药材的供试品溶液较理想［8，11，15］。

3.2 检测波长的选择 取异槲皮苷、槲皮苷及槲皮素对照品溶液在200～400 nm范围内进行紫外吸收扫描，结果异槲皮苷、槲皮苷及槲皮素均在360 nm有较大吸收，且实验对256 nm、350 nm、360 nm下样品溶液的色谱峰进行了比较，结果显示，在360 nm下基线平稳，各分析成分峰形较好。故选择360 nm作为本实验的检测波长。

3.3 流动相的选择 本实验考察了流动相磷酸水溶液的不同百分数 (0.1%磷酸溶液，0.2%磷酸溶液，0.4%磷酸溶液)，结果显示0.2%磷酸溶液与0.4%磷酸溶液分离效果较好，且改善峰的拖尾现象，但二者差别不大，考虑到对色谱柱的保护则选择甲醇-0.2%磷酸溶液为流动相。实验也考察了流动相的不同比例 (44∶56，45∶55，40∶60，34∶66，32∶68)，不同温度 (30℃，35℃)对出峰时间、杂质成分的出现情况、峰型及分离度的影响，最后选定了甲醇-0.2%磷酸溶液 (34∶66)为流动相;柱温35℃作为分析条件。

3.4 成分含有量的差异 比较购自8个产地的合欢花药材中异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素的量，发现不同产地购买的合欢花药材中此3类黄酮类的量差异较大。造成差异的原因可能是采摘的不同季节、不同生长环境及储藏方式不同等。

3.5 小结 《中国药典》2010年版关于合欢花药材只是对单一成分槲皮苷进行了定量分析，本实验建立了同时测定合欢花中异槲皮苷、槲皮苷及槲皮素3种黄酮类的量的高效液相色谱法，且方法灵敏度高，简便，重复性好，为深入研究合欢花的物质基础提供一定方法依据。

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