中药枳壳葡萄内酯活性代谢产物的色谱筛选※

● 黄 群 杨 改红 袁 金斌 杨武亮 陈 海芳 杨 明

老年痴呆严重影响老年人的健康和生活质量，同时给家庭和社会带来巨大经济压力和负担。乙酰胆碱酯酶抑制剂(acetylcholinesterase inhibitor，AchEI)是防治该病的主流药物，寻找新的AchEI一直是该类药物研发的热点［1］。近年来，本实验室已从中药枳壳中筛选得到一种温和的AchEI，即葡萄内酯。葡萄内酯在大鼠体内的药代动力学［2－4］和代谢特性实验表明:葡萄内酯口服给药后，迅速被代谢转化，血浆中检测不到原形药物，几个代谢产物随给药时间呈规律变化，起药效作用的可能是其代谢产物。

药物代谢研究是药物早期筛选的重要研究内容。但是由于药物的代谢产物样品量少、基质复杂，使得活性代谢产物的筛选几乎不可能按照传统的“分离→纯化→筛选”模式进行［5］。高效液相色谱(HPLC)具有分离效率高、灵敏度好、检测手段多等优点，是目前分离分析中最常用的方法，将其与活性筛选相结合可以对活性物质进行有目的的跟踪，使活性物质被发现和分离的时间大大缩短［6］。

近年来，各种色谱联用技术在天然产物包括中药活性物质筛选中的应用越来越多［6－10］。本文拟开发一种色谱与生物活性检测、紫外检测和质谱检测的多维联用技术，筛选鉴定葡萄内酯的活性代谢产物，为其进一步开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与实验动物 葡萄内酯为从枳壳中分离纯化得到，采用高效液相色谱法检查其含量不低于98%;乙酰胆碱酯酶(BR，220U/mg)、联硫代双硝基苯甲酸(DTNB)购自国药集团化学试剂有限公司;牛血清蛋白(BSA)购自杭州四季青试剂公司;其它试剂均为分析纯。SD大鼠，♂，体重200～220g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养管理条件:塑料盒饲养;自由摄水，光照12小时明暗交替。

1.2 实验仪器 Agilent 6410液相色谱－三级四极杆质谱联用仪(Agilent科技，USA)、Agilent 1200液相色谱仪、Waters 510色谱泵、0.5mm内径300μl体积的PFA环管(反应器)、高速冷冻离心机(SIGMA－18，SIGMA 公司，德国)、普通离心机(XiangYi L500，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.3 方法原理 如图1所示，在辅助泵的驱动下，AchE和与巯基显色剂DTNB按比例混合，继而与ASch(硫代乙酰胆碱)混合，然后在反应环管中发生特异性反应，AchE水解ASch生成硫代胆碱和乙酸。硫代胆碱与DTNB反应形成黄色化合物TNB，其于412nm处有特征吸收。进样后，如果样品中含有AchE抑制剂，则其先与AchE反应，而与ASch反应的AchE减少，生成的TNB减少，检测器信号降低，在色谱图上表现为负峰。在生物活性检测与HPLC在线联用的基础上，同步进行HPLC与二极管阵列检测(DAD)及质谱(MS)的联用分析，就能同时实现活性化合物的在线筛选和迅速的结构鉴定。

图1 仪器配置及分析流程图

1.4 溶液制备 实验全程使用50mM的Tris－HCl缓冲溶液。以缓冲溶液溶解AchE得到1000U/mL的储备溶液，储存于低温冰箱。用0.1%BSA(溶于缓冲溶液)逐次稀释储备液，得到AchE工作溶液。含0.1M NaCl和0.02M MgCl2的缓冲溶液用于制备DTNB溶液。直接用重蒸水制备ASch溶液。

1.5 样品制备 葡萄内酯以0.4%CMC－Na溶液浑悬，灌胃给药，剂量为 30mg/kg，于 0，30，60和90min自眼眶后静脉丛取血。血样经肝素抗凝，4000r/min离心10min分离血浆。取血浆200μL，加1mL乙酸乙酯，涡旋混匀，静置分层，4000r/min离心5min分离乙酸乙酯层，重复1次，合并萃取液;乙酸乙酯层置氮气下吹干，加100μL甲醇溶解残渣;甲醇溶液于15000r/min离心10min，上清液用于色谱分析。

1.6 AchE抑制剂的色谱筛选 色谱条件:Dikma Diamonsil C18(4.6 ×250mm，5μm)色谱柱;乙腈―0.1%甲酸梯度洗脱(梯度条件见表1);流速:1.0mL/min，分流至质谱0.4ml/min，分流至生化反应与检测系统40μL/min;322nm为葡萄内酯及其代谢产物的检测波长。串联质谱条件:电喷雾离子化(ESI);毛细管电压4.5kv;脱溶剂气温度:350℃;气体流量:10L/min;喷嘴压力:40psi。生化反应与检测系统:用低死体积的PEEK毛细管(内径64μm)连接整个反应体系;反应物的浓度分别为0.1mM DTNB、0.1U/mL AchE和0.1mM ASch;所有反应物的流速均为40μL/min;反应环管置于50℃的水浴中。检测波长为412nm。

表1 流动相的梯度洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 生化反应条件的优化 硫代乙酰胆碱(ASch)－联硫代双硝基苯甲酸(DTNB)分光光度法是AchE的标准分析方法，反应温度一般为37℃。为加快反应速度，本文采用50℃作为反应环管的温度。如图1所示，相对于代谢产物的质谱和UV(322nm)检测，生化检测由于反应环管及整个管路的延长，化合物的保留时间延迟了近4min。我们以葡萄内酯为模型药物，以UV信号为指标对各反应物的浓度、流速进行了系统比较，结果发现当DTNB为0.1mM，AchE为0.1U/mL，ASch为0.1mM，且流速为40μL/min，系统的背景噪音较小，信噪比较大。

图2 血浆样品的典型HPLC－DAD－ESI－MS/MS色谱图

2.2 葡萄内酯主要代谢产物的分析 课题组在大鼠药代动力学研究中已经发现血浆中有疑似代谢产物随给药时间的变化而变化。为此着手建立了葡萄内酯原型药及其可能的代谢产物的色谱联用分析技术，相关的色谱图见图2，图中两个代谢产物的分子结构已确认(相关工作另文报道)。由于多数药物的代谢物保留了原药分子的骨架结构或一些亚结构，因此，代谢物可能进行与原药相似的裂解，丢失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征离子。用串联质谱进行中性丢失扫描、母离子扫描以及子离子扫描，即可迅速找到可能的代谢物，并鉴定出结构。

2.3 活性代谢产物的筛选 葡萄内酯活性代谢产物的筛选结果见图3，色谱图中的负峰代表可能的活性代谢产物。经过系统比对，发现保留时间(tR)为14和16分钟的两个负峰与图2中检出的两个代谢产物呈对应关系(保留时间延迟4min)。从图2可以看出，前一个色谱峰大于后一个色谱峰，而图3的结果正好相反，后一个代谢产物的乙酰胆碱酯酶抑制活性更强。

3 结论

本文所提出来的色谱联用技术已成功地应用于葡萄内酯活性代谢产物的在线筛选，为葡萄内酯的进一步开发利用提供了基础。如能继续改进灵敏度，该法可以应用于生物体系中乙酰胆碱酯酶抑制剂的分离、筛选和鉴定。

图3 葡萄内酯代谢产物(1h的血样)生化检测的典型色谱图

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