胸腺瘤患者胸腺淋巴细胞Fas表达与重症肌无力的相关性

张其刚 齐科雷 曲晓翰 许广辉 刘洋 杨焱淼

MG是一种以骨骼肌无力为主要表现，由乙酰胆碱受体抗体介导的针对神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体的自身免疫性疾病［1］。胸腺是触发并维持这种自身免疫反应的场所，T淋巴细胞免疫异常在MG发病中占有重要地位。本研究通过检测胸腺瘤患者血清和胸腺淋巴细胞Fas表达变化以及基因结构改变，对MG的发病机制进行研究和探讨。

1 对象和方法

1.1 观察对象 收集中国医科大学附属第一医院胸外科2000-01-01－2011-12-30 期间收治的胸腺瘤手术患者共131例，按是否合并MG分两组。MG患者均以典型临床症状加新斯的明试验和肌电图检查阳性作为确诊依据［2］，并通过病史和相关检验如甲状腺功能检测、血细胞分析等排除MG以外的其他自身免疫性疾病。（1）胸腺瘤合并MG组：70例，其中男30例、女40例，平均年龄42.2岁。其中按WHO胸腺瘤病理分型，A型15例，AB型12例，B1型20例，B2型14例，B3型9例；按Masaoka胸腺瘤临床分期，Ⅰ期27例，Ⅱ期24例，Ⅲ期14例，Ⅳa期5例；按Osserman MG临床分型，Ⅰ型25例，Ⅱa型20例，Ⅱb型16例，Ⅲ型7例，Ⅳ型2例。（2）胸腺瘤不合并MG组：61例，男30例、女31例，平均年龄45.6岁。其中按WHO胸腺瘤病理分型，A型13例，AB型13例，B1型17例，B2型12例，B3型6例；按 Masaoka胸腺瘤临床分期，Ⅰ期26例，Ⅱ期21例，Ⅲ期11例，Ⅳa期3例。胸腺瘤合并 MG组患者除 MG外，不合并其他自身免疫性疾病，胸腺瘤不合并MG组患者不合并任何自身免疫性疾病。两组年龄、性别、胸腺瘤病理分型及临床分期等差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 血清sFas检测：术晨空腹采集患者肘静脉血4mL，无抗凝，分离血清，采用酶联免疫吸附法检测两组血清sFas水平。

1.2.2 胸腺淋巴细胞Fas检测：切除胸腺组织常规制作石蜡标本切片以SP法免疫组织化学染色［3］，观察两组胸腺淋巴细胞Fas表达状况。胞膜或胞质被染成棕黄色者为Fas表达阳性细胞。采集免疫组化图像（400倍）输入到显微图像分析仪，利用计算机图像分析系统测定两组病例胸腺淋巴细胞Fas染色程度积分灰度值，积分灰度值越大，提示Fas蛋白表达量越高。

1.2.3 Western blot检测Fas蛋白表达：取术中获取新鲜胸腺组织，去筋膜和血污，剪碎过80目无菌不锈钢网，制成胸腺单细胞悬液，再经淋巴细胞分离液分离出胸腺淋巴细胞，制成胸腺淋巴细胞悬液备用。取胸腺淋巴细胞悬液，以细胞裂解缓冲液裂解细胞，离心提取上清，电泳，应用100bp梯度Markers作为相对分子质量（Mr）大小对照，确定目的条带（Mr 45 000），剔除其他蛋白条带，将目的条带转膜，PBS洗膜，ECL显色，UVP凝胶成像，应用凝胶成像仪，进行成像分析，测定两组目的条带的灰度值，与内参GAPDH（Mr 37000）的灰度值进行比较，该比值作为每个标本Fas蛋白相对表达量。相对表达量越大，提示Fas蛋白表达量越高。

1.2.4 RT-PCR 法检测 Fas mRNA 表达：采用Trizol试剂一步法提取胸腺淋巴细胞总RNA，按superscriptⅡTM试剂盒说明以RNA为模板，Oligo5.0为引物进行反转录，根据基因数据库中Fas mRNA序列设计1-9外显子的引物［4］，以cDNA第一链为模板行PCR扩增（95℃1min，56.5℃1 min，72℃1min，共30个循环）。Fas上游引物5′－ATGCTGGGCATCTGGACCCT-3′，下游引物5′－CACTCTAGACCAAGCTTTGG-3′，扩增片段长度为 1011bp，β-actin 上 游引 物 5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3′，下 游 引 物 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3′，扩增片段长度472bp。Fas和β-actin两个反应体系的产物与 Marker再经琼脂糖凝胶电泳后，紫外线下成像。β-actin为根据Genbank提供的Fas mRNA序列而设计的mRNA内参照序列，Marker为100bp梯度的序列标记mRNA，两者一起用于确定Fas mRNA目的条带。应用凝胶成像仪，进行成像分析，测定两组目的条带的灰度值，与β-actin灰度值进行比较，该比值作为每个标本Fas mRNA的相对表达量。相对表达量越大，提示Fas mRNA表达量越高。

1.2.5 Fas基因测序分析：随机选取两组胸腺淋巴细胞悬液各20例，按试剂盒操作提取基因组DNA，测D（λ）260nm值。D（λ）260nm值为1相当于50 μg／mL双链DNA，据此计算所提取的DNA浓度，确定为配制反应体系时加入量。根据GeneBank查找的Fas基因序列［4］，分别设计各个外显子的引物，PCR扩增（94℃3min，94℃30s，72℃2min，共30循环，之后72℃5min）。取扩增后样本15 μL，Marker 3μL，加入loading buffer 3μL，混匀，电泳，根据GeneBank中查到的Fas基因1-9外显子分子量和100bp梯度Marker标记确定外显子目的条带，作为PCR产物原液，送TIANGEN公司测序，测序结果经过chomas145-95软件分析，有差异者须再经过3次双向测序证实为异常碱基而非随机误差。将测得序列再与GENEBANK上的Fas基因外显子序列进行对比并结合单核苷酸多态性进行氨基酸变异情况分析。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件分析。两组所测得的实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清sFas水平 胸腺瘤合并MG组，血清sFas水平为（3879.06±706.51）pg／mL，明显高于胸腺瘤不合并 MG组（1868.18±391.46）pg／mL（t＝63.19，P＜0.05）。

2.2 胸腺淋巴细胞Fas表达 胸腺瘤合并 MG组胸腺组织内淋巴细胞Fas蛋白染色程度与上皮细胞相比明显减弱（图1A），胸腺瘤不合并MG组胸腺组织内两种细胞Fas蛋白染色程度基本相同（图1B）。胸腺瘤合并MG组淋巴细胞染色积分灰度值（9.16±3.13）高于胸腺瘤不合并 MG 组（36.56±5.83）（t＝14.539，P＜0.05）。

2.3 胸腺淋巴细胞Fas蛋白表达 胸腺瘤合并MG组Fas蛋白相对表达量为1.47±0.35，明显低于胸腺瘤不合并 MG 组（3.67±0.55）（t＝18.58，P＜0.001）（图2）。

2.4 胸腺淋巴细胞Fas mRNA表达 胸腺瘤合并 MG组Fas mRNA相对表达量为1.39±0.34，明显低于胸腺瘤不合并 MG组（2.49±0.32）（t＝13.10，P＜0.001）（图3）。

图1 两组患者胸腺Fas表达（SP法×400）

图 2 两组胸腺瘤患者胸腺淋巴细胞Fas蛋白表达差异（Mr 45 000，Western blot）

图 3 两组胸腺淋巴细胞Fas mRNA表达（RT-PCR）

图 4 Fas基因第3、6、7号外显子测序截图（图中箭头所示为突变的位点）

2.5 Fas基因测序 两组患者胸腺淋巴细胞均检测到Fas基因第3、6、7外显子碱基置换突变发生（图4）。其中3号和7号外显子各有一个突变位点，分别为G→A和T→C碱基置换突变，但不改变编码氨基酸的类型，两组发生概率基本相同。6号外显子共发现有5个突变位点，其中3个位点（7、20、60位点）分别为G→A、T→G和T→G突变，发生率两组基本相同，在5%～15%之间；另两个位点（16、21位）均为T→G突变，所编码氨基酸分别发生 TTG（Leu，亮氨酸）→TGG（Trp，色氨酸）和TGG（Trp）→GGG（Gly，甘氨酸）改变，胸腺瘤合并MG组发生率分别为65%和75%，均高于胸腺瘤不合并 MG组的发生率（均为5%）（t＝15.12，P＜0.05）。

3 讨论

MG患者机体存在体液和细胞免疫功能异常，多有胸腺增生或胸腺瘤等胸腺的病理改变［5］。约50%～70%的胸腺瘤患者合并不同程度MG。临床观察发现，Masaoka临床分期或WHO病理分型相同的胸腺瘤患者，有的合并不同分型的MG，有的却不合并任何自身免疫性疾病，提示胸腺瘤分型和分期与MG无明确相关性，或相关性不明显［6］。本研究中作者收集两组不同病理分型和临床分期的胸腺瘤患者，检测并比较各自胸腺的病理改变，探讨其胸腺内淋巴细胞结构和免疫功能改变是否与MG发病有关。

胸腺是中枢免疫器官，前T淋巴细胞在此先分化形成CD4＋CD8＋双阳性细胞，再分别经阳性选择、细胞凋亡和阴性选择等，最终形成功能性淋巴细胞［7］，其中淋巴细胞凋亡对维持机体内环境及免疫功能的稳定，防止自身免疫性疾病的发生极具重要意义，而胸腺淋巴细胞阴性选择与Fas介导的细胞凋亡密切相关［8］。Fas属于肿瘤坏死因子／神经生长因子受体家族成员，分布于淋巴细胞表面，主要以膜分子（mFas）形式存在，少部分呈可溶性（sFas）形式。mFas是功能完整的跨膜糖蛋白，表达于淋巴细胞膜和胞质，sFas是编码mFas mRNA发生拼接变异时产生的少量缺乏跨膜区域的结构变异Fas［9］。人Fas基因包括9个外显子，外显子2-5编码膜外端，外显子6编码跨膜区，外显子7－9编码膜内端。有文献报导Fas缺陷的突变鼠和人类易患淋巴细胞增生性疾病（LPr）和系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫性疾病［10］，说明异常的细胞凋亡在自身免疫性疾病发病中具有重要地位，淋巴细胞凋亡缺陷主要与Fas基因调控异常有关［11］，因此检测胸腺淋巴细胞Fas的变异对于探讨MG的发病机制具有重要意义。

血清中少许sFas主要为Fas mRNA以不同方式进行剪接加工后的翻译产物，明显升高则多为Fas基因突变导致Fas mRNA表达异常。缺乏跨膜区的sFas易从自身反应性T细胞膜上脱落，使其丧失部分与Fasl结合位点，未脱落的sFas又与淋巴细胞膜上的Fas（主要为mFas）竞争性结合Fasl导致Fasl与自身反应性T细胞mFas结合水平下降，下调自身反应性T细胞凋亡［12］。本研究结果显示，在Fas蛋白表达上，胸腺瘤合并MG组患者胸腺淋巴细胞Fas明显减少，表达明显减弱，而血清中sFas水平明显高于胸腺瘤不合并MG组，提示MG患者的胸腺淋巴细胞存在Fas mRNA表达异常和Fas基因异常，可能是诱发MG等自身免疫性疾病的原因。

本研究中对Fas基因进行测序和突变检测分析显示，两组患者胸腺淋巴细胞均有第3、6、7号外显子碱基置换突变发生。其中3号外显子和7号外显子各有1个突变位点，但不改变所编码氨基酸的类型，且两组发生的概率基本相同，均在15%～25%之间。6号外显子共发现有5个突变位点，且均会改变编码氨基酸的类型。其中3个位点的突变发生率两组基本相同，在5%～15%之间。另外2个位点（第16、21位）均为T→G碱基置换突变，所编码氨基酸分别发生TTG（Leu）→TGG（Trp）和TGG（Trp）→GGG（Gly）改变，胸腺瘤合并 MG组发生率分别为65%和75%，明显高于胸腺瘤不合并MG组（发生率均为5%）。由于6号外显子编码Fas蛋白跨膜区，其发生基因突变可能会造成Fas蛋白跨膜区结构变异或消失，机体出现淋巴细胞表面mFas减少，血清中缺乏跨膜区的sFas增多现象，与上述实验结果相互对应。因此，可以推测，MG发生的根本原因可能是胸腺淋巴细胞Fas基因突变，尤其是外显子6的某些位点突变而导致的Fas蛋白跨膜区的缺陷，MG只是Fas基因突变引起的自身免疫性疾病之一，与近年来文献报导相符［13］。同时也可以对有些胸腺瘤合并MG患者同时还伴有甲亢、单纯红细胞贫血、扁平苔藓及SLE等多种自身免疫性疾病以及有些患者在切除胸腺瘤数年后还可出现MG等现象进行解释。

胸腺瘤和全胸腺扩大切除是目前治疗MG的首选方法，有一定疗效，但并不理想，尤其是全身型MG，病史较长者，术后仍需长期服药，症状时有反复，其主要原因是血清及胸腺以外的淋巴器官内仍有释放抗乙酰胆碱受体抗体等自身抗体的淋巴细胞没有被清除，MG治疗仍是一个临床难题。如能在基因水平诱导淋巴细胞凋亡，以抑制抗乙酰胆碱受体抗体等自身抗体的产生，有可能为MG的治疗提供有效的对因治疗方法。

综上所述，MG可能是一种包括Fas等自身基因控制的自身免疫性疾病，在基因水平诱导淋巴细胞凋亡，以抑制抗乙酰胆碱受体抗体等自身抗体的产生，有可能为MG的治疗提供有效的对因治疗方法，有必要在今后的研究工作中进行探索。

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