姜露散对大鼠感染性创面提脓祛腐的作用及机制

王佳雯 陆金根 曹永清 潘一滨

(上海中医药大学附属龙华医院肛肠科，上海，200032)

升丹是目前临床应用的主要提脓祛腐药物。但近年临床和动物实验均表明溃疡创面应用升丹都会有不同程度的汞吸收，其毒性有蓄积性，可对内脏等造成损害，甚至可以引起中毒致死。其他类提脓祛腐药物大多数也是有毒性的药物。因此，寻求高效、无毒的升丹替代品无疑成为中医外科工作者迫在眉睫的任务［1－3］。上海中医药大学附属龙华医院陆金根教授通过对古代医籍和现代文献的回顾性理论研究［4－19］，并结合中医外科多年的临床用药经验，拟方姜露散。本研究通过动物实验，观察该方对感染性创面提脓祛腐的作用，并探讨其作用的可能机制及用药安全性，为中药提脓祛腐药物提供高效、无毒的升丹替代品。

1 材料与方法

1.1 动物 健康SD大鼠72只，SPF级，体质量200～220 g/只，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，饲养于上海中医药大学附属龙华医院科研中心。

1.2 药物 姜露散由上海中医药大学附属龙华医院制剂室制备。九一丹由上海华鹰药业有限公司提供。

1.3 细菌 采用上海市临床检验中心提供的大肠埃希菌标准菌株(ATCC 25922)，配制成浓度为5亿菌株/mL的大肠埃希菌混悬液。

1.4 主要试剂与仪器 溶酶体抗体(美国Santa Cru)、EnVision 试剂即用型(丹麦 Dako)、3＇3 － 二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)显色液试剂盒(武汉博士德)、大鼠IL－1β定量ELISA试剂盒(美国RD);生物显微镜(Olympus BH2)、数码相机(Nikon E4500)、紫光分光光度计(日本Beckman Du－600)、全自动生化检测分析仪(OLYMPUS AU460)。

1.5 方法

1.5.1 分组、造模与给药 参照上海中医药大学附属曙光医院张雅明［20］以及南京市中医院郑雪平［21］等造模方法，并改良付小兵［22－23］全层皮肤缺损法建立大鼠感染性创面模型。在麻醉后的大鼠颈背部作一直径2 cm的圆形切口，深达肌筋膜，破坏部分肌肉表面筋膜，止血后在创面上覆盖大小相仿的纱布，纱布中浸入新培养的大肠埃希菌标准菌株1 mL(约5亿菌株)。3 d后，创口表面附有脓性分泌物，周围皮温略升高，感染性创面模型造模成功。将大鼠随机分为三组:姜露散组、九一丹组、模型组，每组24只。造模各组大鼠每天分别给予姜露散、九一丹创面换药，模型组给予生理盐水创面换药，1次/d，连续治疗14 d。

1.5.2 观察大鼠一般情况 包括精神状态、活动情况、进食量、大小便情况。

1.5.3 创面脓腐脱落时间 从用药开始到脓腐脱落的时间(通过创面色泽的变化判断，即当创面变为鲜红色，见到肉芽组织为止)。

1.5.4 创面分泌物量 第3、7、14 d，无明显分泌物，计0分;分泌物量少，用一根消毒棉签可以吸净，计1分;分泌物量较多，用二根消毒棉签可以吸净，计2分;分泌物量大，用二根以上消毒棉签可以吸净，计3分。

1.5.5 免疫组化EnVision法检测创面肉芽组织中溶菌酶含量 第3、7、14 d，各组随机处死8只大鼠，取近创缘约0.5 cm×0.5 cm的肉芽组织，按免疫组化试剂盒操作说明进行。对每张免疫组化片高倍镜下(×250)随机取3个视野窗，在OLYMPUS 1X70倒置荧光图像采集分析系统上利用Imge－Pro Plus分析软件，将阳性细胞用像素点表示并换算成μm2，采用Imagepro－plus图像分析系统分析软件，以阳性反映细胞总面积代表阳性反应细胞数，结果取均值。

1.5.6 双抗体夹心ABC－ELISA法检测创面肉芽组织中IL－1β含量 第3、7、14 d，各组随机处死8只大鼠，取近创缘约100 mg的肉芽组织，按大鼠IL－1β定量ELISA试剂盒操作说明进行。以标准品不同稀释浓度为横坐标，光学密度值(optical density，OD)为纵坐标作标准曲线图，根据样品OD值查出相应IL－1β含量。

1.5.7 酶法检测主要肝肾功能指标 第7、14 d，各组随机处死8只大鼠，腹主动脉采血。将取得的血清置于全自动生化检测分析仪中，直接读取血清BUN，CREA，ALT值。

1.5.8 统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行数据处理及分析，实验数据以(s)表示，方差齐者用LSD法，方差不齐者用Dunnett＇s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 造模成功后各组动物都呈病态，皮毛杂乱，倦缩少动，摄食量、摄水量明显减少。

表1 各组创面脓腐脱落时间比较(d，s)

表1 各组创面脓腐脱落时间比较(d，s)

注:与模型组比较，＊＊P＜0.01;与九一丹组比较，*P＞0.05。

*姜露散 16 6.67±0.651 16 9.67±0.888九一丹 16 7.08±0.900＊＊模型

表2 第3 d、7 d、14 d、各组创面分泌物量计分比较(s)

表2 第3 d、7 d、14 d、各组创面分泌物量计分比较(s)

注:与模型组比较，＊＊P＜0.01;与九一丹组比较，*P＞0.05。

7 d组别 3 d 14 d只数 计分姜露散 24 2.39±0.502＊＊ 16 1.67±0.651* 8 0.67±0.516只数 计分 只数 计分*九一丹 24 2.33±0.485＊＊ 16 1.33±0.492* 8 0.50±0.548*模型 24 1.78±0.428 16 1.25±0.452* 8 0.33±0.516*

表3 各组创面肉芽组织中溶菌酶含量比较(μm2，s)

表3 各组创面肉芽组织中溶菌酶含量比较(μm2，s)

注:与模型组比较，＊＊P＜0.01。

姜露散 8 1283.3550±66.39142＊＊1266.5400±70.97180＊＊597.9617±71.72339九一丹 8 1276.5467±73.77489＊＊1258.2908±75.02942＊＊ 559.6925±55.83410模型 8 691.9958±206.29910 749.2492±65.48238 602.9333±78.02048

表4 各组创面肉芽组织中IL－1β含量比较(pg/mL，s)

表4 各组创面肉芽组织中IL－1β含量比较(pg/mL，s)

注:与模型组比较，＊＊P＜0.01。

3 d 7 d 14 d姜露散 8 51.6633±9.44752＊＊ 27.9583±7.54641＊＊组别 只数13.6467±2.93296九一丹 8 50.6633±8.64725＊＊ 27.0633±7.56325＊＊ 12.4250±2.38189模型 8 14.1333±3.7858 11.6967±2.25507 11.2200±2.28874

2.2 各组创面脓腐脱落时间比较 见表1。

2.3 各组创面分泌物量比较 见表2。

2.4 各组创面肉芽组织中溶菌酶含量比较 见表3。

2.5 各组创面肉芽组织中IL－1β含量比较 见表4。

2.6 各组血清BUN、CREA、ALT含量比较 见表5。

表5 各组血清BUN、CREA、ALT含量比较(s)

表5 各组血清BUN、CREA、ALT含量比较(s)

注:与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与九一丹组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

CREA(mmo1/L)组别 只数 BUN(mmo1/L)ALT(U/L)7 d 14 d姜露散 8 7.2283±0.24302△ 8.0167±0.76995△ 35.1033±3.13722△ 33.8683±3.79128△ 38.7000±4.93994△ 38.6400±4.36148 7 d 14 d 7 d 14 d△△九一丹 8 9.1700±1.14745* 10.5850±1.80280*47.2250±2.43482*49.4300±2.27716*43.6317±2.48398*52.9633±9.04799＊＊模型 8 6.6583±0.29546 7.0533±0.33285 32.8667±2.40935 32.6983±2.32029 37.3183±2.90987 39.7467±2.32760

3 讨论

3.1 中医对“提脓祛腐法”的认识 “提脓祛腐法”是中医外科治疗急慢性感染性创面的治疗大法之一，其包含“提脓”和“祛腐”两个方面的内容。“提脓”为化腐成脓，只有将腐肉转化成脓汁，才能利于创面的引流;同时，“脓”本身又能促进创面的愈合及加强创面的炎性反应。“祛腐”即通过药物或手术的作用，将创面上的坏死组织、过度增生的病理性肉芽组织以及其他影响创口顺利愈合的各种病理组织(如囊壁、瘘管壁等)逐渐清除，形成相对新鲜的、引流通畅的创面，为新生肉芽组织的生长创造有利条件。“祛腐”是“提脓”的目的;“提脓”是“祛腐”的方式和手段。提脓祛腐药物疗法是中医的特色和优势。肛肠科常见的感染性疾病(肛周脓肿和肛瘘)的术后创面都是经过一定的手术清创过程，但是对于深部肛周脓肿及复杂性肛瘘，前者术中无法做到彻底清创，后者临床为了保护肛门括约肌正常形态及功能，不可能将瘘管全部切除，如果能够使用提脓祛腐药物配合术后换药，便能加快创面坏死及病理组织的脱落，缩短创面愈合的时间。再者，某些肛肠手术切口较小，导致术后创面引流不畅，局部出现感染或慢性炎性反应至胬肉增生时，如果能够使用提脓祛腐药物进行换药，便能避免部分术后并发症的发生。此外，肛肠疾病中藏毛窦、骶前囊肿等疾病，其手术成功的关键是彻底清除病理组织，但有时由于结构的复杂性和种种限制，无法全面彻底地清除这些病理组织，此时如果能够使用提脓祛腐药配合术后换药，便能够大大提高治疗的成功率［24］。因此，提脓祛腐药物疗法在肛肠科乃至整个中医外科学领域承担着非常重要的任务。

3.2 西医对“提脓祛腐法”的认识 “提脓祛腐法”是一种湿润的药物清创法，与西医学近年发展起来的“酶学清创”在方法与效果上相似。两者虽源于不同医学，但却殊途同归［24－28］。

3.3 升丹制剂不良反应 升丹制剂在临床上疗效显著，已沿用千余年，但升丹制剂具有一定的不良反应，过量可导致肝肾损害。其主要化学成份是粗制的HgO及Hg(NO3)2等，属中等毒性药物。临床和实验表明通过皮肤创面外用升丹制剂都有不同程度的汞吸收，其毒性有蓄积性，造成内脏的损害，甚至导致中毒死亡［29－32］。其主要的靶器官是肾脏。

3.4 姜露散全方由姜黄、露蜂房、皂角刺等组成，具有清热解毒，提脓袪腐之功效 本研究结果显示，姜露散组和九一丹组创面脓腐脱落时间均明显短于模型组(P＜0.01);姜露散组和九一丹组第3 d创面分泌物量计分均明显高于模型组(P＜0.01)。提示姜露散和九一丹能够迅速“化腐提脓”，促进创面腐肉脱落，将其转化成脓汁，使得创面引流通畅，从而促进新生肉芽组织的生长。第3、7 d姜露散组和九一丹组创面肉芽组织中溶菌酶含量均明显高于模型组(P＜0.01)。溶菌酶含量分布基本表现为先升高后逐渐下降的趋势，与创面炎性反应的时间和程度变化基本一致，而姜露散组与九一丹组第3 d溶菌酶含量就达到峰值，至第7 d时仍然保持高水平，第14 d显著下降，且姜露散组溶菌酶含量相对较高，提示姜露散能有效地趋化和活化吞噬细胞，使得吞噬细胞能够迅速聚集在感染创面处，来清除细菌、中和异物及细菌所产生的毒素，溶解及清除坏死组织;渗出的蛋白凝固后成为创面的保护屏障，起到为炎性反应细胞移动提供网架结构等作用。这些作用为下一步的创面修复打下了良好的基础。因此，提高创面肉芽组织中溶菌酶的含量以调节机体局部免疫功能可能是姜露散提脓祛腐作用的机制之一［24，33］。第3、7 d姜露散组、九一丹组创面肉芽组织中IL－1β含量均明显高于模型组(P＜0.01)。各组创面肉芽组织中IL－1β含量基本在第3 d时达到峰值，此后逐渐下降，可能与第3 d时炎性性反应程度最高有关。创面肉芽组织中的IL－1β为血管促进因子和炎性反应因子，能够刺激创伤修复早期炎性反应，从而促进创面的修复。这可能也是解释姜露散提脓祛腐的作用机制之一［24，33］。第7、14 d 血清 BUN、CREA、ALT 含量，九一丹组明显高于姜露散组和模型组(P＜0.05)。提示姜露散对肝肾功能影响小，用药安全性优于九一丹。

综上，姜露散可能通过提高创面肉芽组织中溶菌酶含量及创面肉芽组织中IL－1β含量来起到对感染性创面提脓祛腐的作用，其用药安全性优于升丹制剂(九一丹)，为寻找升丹制剂替代品提供更多选择空间。本次实验仅从创面肉芽组织中溶菌酶、IL－1β等方面探讨姜露散提脓祛腐的作用机制，如需进一步明确其机制，还有待大样本的多靶点的研究。

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