高效液相色谱法测定双花解毒合剂中绿原酸含量

肖顺林，罗宏丽，冯碧敏

(泸州医学院附属医院药剂科，四川 泸州 646000)

双花解毒合剂是由金银花、黄芩、板蓝根、连翘、麦冬5味中药制成的中药复方制剂，具有清热解毒、利咽止咳等功效，适用于外感风热所致咽喉肿痛、口干咳嗽、急性上呼吸道感染、急性咽炎、扁桃体炎、支气管炎等病症[1－3]，已在临床应用多年且疗效确切。金银花为本方的主药之一，主要成分为绿原酸，具有治疗呼吸道感染、消炎解毒、凉血散热的功效。现将绿原酸作为控制双花解毒合剂质量的指标，采用高效液相色谱法对其含量进行了测定，其结果报道如下。

1 仪器与试药

Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司);Kromasystem 2000色谱工作站(Bio.Tek Instrument Snl公司);Hamiltn ASO－0023型液相色谱进样器;Sartorius 1712型分析天平(德国Sartorius公司);AS10200型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为100203);双花解毒合剂(泸州医学院附属医院，川药制字 Z20070512，批号分别为 100203，100302，100303，100401，100402，规格为每支20mL);磷酸二氢钠为分析纯，乙腈为色谱纯(美国Tedia公司)，水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:HypersilC18柱(250mm×4.6mm，5μm);柱温:40℃;流动相:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH至3.2)－甲醇(87 ∶13);流速:1.0mL/min;检测波长:327 nm;进样量:20 μL。

2.2 溶液制备

精密称取绿原酸对照品18.2mg，置50mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含364μg的绿原酸溶液，作为对照品贮备液(于10℃以下保存)。精密量取双花解毒合剂1mL，置具塞离心管中，加50%甲醇3mL，摇匀，于冰箱中放置过夜。药液过夜后，置离心机，以3 000 r/min的速度离心15min，上清液转移至10mL容量瓶中。沉淀用2mL 50%甲醇洗涤，洗涤液置离心机，以3 000 r/min的速度离心5min;将两次离心得到的上清液收集至同一容量瓶中，用50%甲醇定容，摇匀即得供试品溶液。按处方比例称取不含金银花的其他药材，按双花解毒合剂生产工艺制备不含绿原酸的阴性样品，按供试品溶液制备方法处理，即得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验:分别精密吸取2.2项下3种溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图。结果，在此色谱条件下，对照品溶液与供试品溶液主成分峰的保留时间基本一致，阴性对照无干扰;理论板数按绿原酸峰计算应大于4 000。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密量取绿原酸对照品溶液(364μg/mL)0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，以 50% 甲醇溶液定容至 2mL，摇匀。分别精密吸取20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以绿原酸峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y=1.165 2X －5.638(r=0.999 1，n=5)。结果表明，绿原酸质量浓度在36.4～182.0μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

精密度试验:精密吸取同一质量浓度对照品溶液(109.2μg/mL)20μL，按拟订色谱条件重复进样 6次，记录峰面积。结果的RSD=1.06%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液适量，在室温条件下分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h 时进样 20 μL，记录峰面积。结果的RSD=1.16%(n=8)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

回收率试验:精密量取已知含量的双花解毒合剂1mL，置离心管中，再分别精密加入低、中、高3种不同质量浓度的绿原酸对照品溶液，依法制备溶液，置10mL容量瓶中，用50%甲醇定容，摇匀，按拟订色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表1。

重复性试验:取同一批(批号为110203)样品6份，依法制备供试品溶液，照拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸的平均含量为 785.239 μg/mL，RSD=1.12%(n=6)，表明方法重复性良好。

表1 绿原酸回收率试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定峰面积，计算样品中绿原酸的含量。结果批号为110203，220417，110525 的样品中，绿原酸含量分别为 776.678，795.832，801.365 μg/mL，其 RSD 分别为 0.52%，0.71% ，0.67%(n=3)。

3 讨论

检测波长选择:检测波长一般在324～330 nm之间，本试验以50%甲醇为溶剂，将对照品溶液及供试品溶液在200～400 nm波长范围进行紫外扫描，确定其检测波长为327 nm。

流动相选择:文献[4－7]采用了0.4%磷酸－乙腈(90∶10)、0.4%磷酸 －乙腈(87∶13)、0.4%磷酸 －乙腈(85 ∶15)作为流动相，本试验曾用0.4%磷酸－乙腈(90∶10)、0.4%磷酸－乙腈(87∶13)作为流动相，结果色谱峰的峰型及峰的对称性较差，拖尾现象较严重，重复性也较差，均不能得到满意的色谱峰，后来选择甲醇－0.2mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH至3.2)作为流动相，并对流动相的比例、柱温和流速进行反复筛选，最后确定了色谱工作条件。在该条件下进行测定，得到了良好的峰形、适当的保留时间和较高的理论板数(均符合药典相关规定)。

提取溶剂选择:在相同条件下，考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇及流动相作为提取溶剂。结果表明，50%甲醇的提取率最高，且甲醇、乙醇、50%乙醇及流动相的样品溶液在放置较短时间(约2 h)后，颜色均有变化，且峰面积有所下降，影响了试验结果的准确性，而用50%甲醇作为溶剂在10 h内均无变化，因此本试验选择50%甲醇作为提取溶剂。

提取时间选择:在相同条件下，考察了样品在15，20，25，30，35min超声后的提取率。结果表明，样品在超声30min时提取率最高，在25min和35min时均未明显提高，因此本试验选择超声30min作为样品的提取时间。

[1]WS3－366(Z－52)－97(Z)，中华人民共和国卫生部药品标准[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:附录114－附录116.

[3]邱华荣，田 吉，冯文宇，等.青银注射液中绿原酸和樟脑的含量测定[J].中成药，2004，26(8):621－623.

[4]余 杰，匡辽红，林凡胜，等.HPLC测定复方双花口服液中绿原酸的含量[J].中国执业药师，2010，7(3):32 －34.

[5]梅 林，赖 容.HPLC法测定复方金银花中绿原酸的含量[J].激光杂志，2010，31(2):6.

[6]唐 奇.HPLC法测定复方金银花颗粒中绿原酸的含量[J].中国现代药物应用，2010，4(19):133 －134.

[7]黄群莲，唐 灿，李婷婷.优选双花解毒合剂金银花超声提取工艺[J].云南中医学院学报，2011，34(5):34－36.