苯并芘氧化损伤鼠肺泡细胞及维生素E对其保护作用的机制研究

初巍巍，霍 阳，陈 悦，宋 涛，赵跃萍，王 莉

苯并芘(Benzo-a-pyrene，BaP)是典型的多环芳烃类化合物(PAHs)，主要来源于能源物质的不完全燃烧，是环境污染物。BaP诱导细胞凋亡的途径很多，研究最多的是氧化应激反应，Billet等［1］研究证明BaP经胃肠道吸收进入血液，在体内转换为羟基化合物或醌类［2］，肝脏代谢过程中产生二氢二醇环氧苯并芘(BaP-7，8-Dihydrodiol-9，10-Epoxide，BPDE)来降低毒性，但代谢过程中产生大量活性氧(ROS)，导致超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性改变，造成细胞氧化损伤坏死［3］。

维生素E作为人体重要营养素，在抗氧化与调节女性内分泌方面起着重要的作用［4］，研究证明维生素E可以有效捕捉、清除超氧阴离子自由基、单线态氧和过氧化氢等，阻断或防止自由基引发的氧化反应，以防止过氧化反应加剧，保护生物膜免受氧化和过氧化损伤，参与调节抗自由基反应的抗氧化酶活性，增加机体对自由基的清除能力，是已被确认的自由基清除剂［5］。而维生素E能否抑制BaP所导致的肺泡细胞氧化损伤，值得我们去深入探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:100只ICR雄性小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK-(京)2007-0001，6～8周龄，体重28～32 g。

1.1.2 主要试剂:维生素E、BaP为sigma公司产品;GSH-PX活性检测、SOD活性检测、丙二醛(MDA)含量检测、ROS活性检测试剂盒均为南京建成生物科技公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验动物的分组与处理:将100只小鼠随机分为A、B、C、D、E 5组，每组 20只，人工控温 20～26℃，12 h光照，12 h黑暗，颗粒饲料喂养，自由饮水取食。A组:BaP 2 mg/(kg·d);B组:维生素E 10 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);C 组:维生素E 20 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);D 组:维生素 E 40 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);E 组:相同体积的橄榄油。BaP与维生素E均用橄榄油配成混悬液，配好后避光4℃保存，现用现配。连续灌胃15 d，最后一次灌胃后用颈椎脱臼法将小鼠处死并放于冰台上，无菌条件下取出肺组织，HE染色制作成切片后观察，可见A、B、C、D组给予BaP后肺泡细胞核呈现棕黄色，固缩，并出现核碎裂，形成凋亡小体，表明肺泡细胞发生凋亡。

1.2.2 实验方法:1周内将取出的肺组织用匀浆机10 000～15 000 r/min的转速研磨，每次10 s，间隔30 s，连续3～4次，温度4℃，按试剂盒说明测定GSH-PX、SOD与ROS活性并检测MDA含量。

1.3 统计学分析 采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，计量资料结果以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 GSH-PX活性 A组肺泡组织中GSH-PX的活性明显低于B、C、D、E 组(P ＜0.05)，B、C、D 组肺泡组织中GSH-PX的活性随着维生素E剂量的增加活性逐渐增强，且3组间活性均有统计学差异(P＜0.05)，B、C、D组血清中GSH-PX的活性均低于 E组(P＜0.05)，结果见表1。

2.2 SOD活性 A组肺泡组织中SOD活性明显低于 B、C、D、E 组(P ＜0.05)，B、C、D 组肺泡组织中SOD活性随着维生素E剂量的增加逐渐增强，但C、D两组间无统计学差异(P＞0.05)，B、C、D 组血清中SOD活性均低于E组(P＜0.05)，结果见表1。

表1 5组鼠肺泡细胞中GSH-PX、SOD活性比较(±s)

表1 5组鼠肺泡细胞中GSH-PX、SOD活性比较(±s)

注:GSH-PX:谷胱甘肽过氧化物酶，SOD:超氧化物歧化酶。A组:苯并芘(BaP)2 mg/(kg·d);B组:维生素 E 10 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);C组:维生素E 20 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);D 组:维生素 E 40 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);E组:相同体积的橄榄油。与E组比较，aP＜0.05;与 A组比较，cP＜0.05;与 B组比较，eP＜0.05;与C组比较，gP＜0.05

组别 鼠数 GSH-PX(μmol/L) SOD(U/ml)20 24.547 ±0.436 242.41 ±8.42 A 组 20 17.231 ±0.452a 184.32 ±8.31a B 组 20 18.382 ±0.433ac 199.52 ±13.21ac C 组 20 21.834 ±0.329ace 221.31 ±9.32ace D 组 20 22.481 ±0.325aceg 224.42 ±10.31 E组ace

2.3 ROS活性 A组肺泡组织中ROS的活性明显低于B、C、D 组(P＜0.05)，高于 E组(P＜0.05)，B、C、D组肺泡组织中ROS的活性随着维生素E剂量的增加逐渐增强，但B、C两组间无统计学差异(P ＞0.05)，B、C、D 组肺泡组织中 ROS的活性均高于E组(P＜0.05)，结果见表2。

2.4 MDA浓度 A组肺泡组织中MDA浓度明显高于B、C、D、E 组(P ＜0.05)，B、C、D 组肺泡组织中MDA的活性随着维生素E剂量的增加浓度逐渐降低(P＜0.05)，B、C组肺泡组织中MDA浓度均低于E组(P＜0.05)，但D、E两组间无统计学差异(P＞0.05)，结果见表 2。

表2 5组鼠肺泡细胞中ROS活性、MDA含量比较(±s)

表2 5组鼠肺泡细胞中ROS活性、MDA含量比较(±s)

注:ROS:活性氧，MDA:丙二醛。A组:苯并芘(BaP)2 mg/(kg·d);B组:维生素E 10 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);C 组:维生素 E 20 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);D组:维生素E 40 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);E组:相同体积的橄榄油。与E组比较，aP＜0.05;与A组比较，cP＜0.05;与B组比较，eP＜0.05;与C组比较，gP＜0.05

组别 鼠数 ROS(U/ml) MDA(nmol/ml)20 573.43 ±28.43 58.75 ±3.31 A 组 20 785.31 ±23.21a 79.32 ±5.42a B 组 20 792.21 ±12.22ac 71.21 ±3.42ac C 组 20 794.56 ±10.31ac 62.21 ±7.52ace D 组 20 945.32 ±32.21aceg 58.43 ±8.42 E组ceg

3 讨论

BaP作为多环芳烃类物质的代表，广泛存在于烟囱、煤焦油、燃烧烟草的烟雾和内燃机尾气以及烹饪油烟和熏炸食物中，为淡黄色长针状结晶体，分子式为C20H12，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于苯、乙醚、丙酮、DMSO等有机溶剂，具有高脂溶性和较强的氧化活性，可导致细胞氧化损伤而造成染色体畸形［6］。维生素E分子式为C31H52O3，天然维生素E为淡黄色油状液体，容易在碱性或酸性物质中变性，暴露于空气中易被氧化，在无水乙醇、丙酮、植物油中易溶解，其抗氧化活性已得到证实。补充维生素E能减少BaP诱导的DNA氧化损伤，改善细胞功能，而且体内实验发现维生素E(100～3200 IU/d)没有明显的致癌或致突变性［7］。

GSH-PX是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异性催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的还原反应。GSH与超氧阴离子自由基(O2－)反应可产生O2，GSH-PX对其他抗氧化剂具有调节作用［3］。SOD是一种带负电荷的金属蛋白酶，能催化超氧阴离子发生歧化反应，从而阻断和防止超氧阴离子所引发的一系列自由基连锁反应的加剧［8］。因此两酶的活性反映了组织的抗氧化能力。本实验结果显示给予BaP灌胃后，其肺泡组织GSH-PX、SOD活性降低，进一步说明BaP能降低机体抗氧化能力，而给予维生素E对抗后两酶的活性明显升高，说明抗氧化剂能提高机体抗氧化能力并能很好地清除肺泡组织中的氧化应激物质。

自由基是指能够独立存在、含有未成对电子的原子、原子团、分子或离子，其中ROS是一种重要的自由基。在正常条件下体内会产生少量自由基，并且有一定的功能，且受控的自由基对人体有利［9］。机体内存在着一整套完整的清除自由基的防御系统，抗氧化酶是其中之一。过多自由基的产生，超出了防御能力，就会对机体产生有害作用。膜脂过氧化物产物MDA的含量增加可以直接反映自由基生成增多。从小鼠肺泡组织的氧化－抗氧化指标检测结果可以看出，BaP处理不但没有降低肺泡组织中ROS活性，反而增加其活性，且GSH-PX与SOD活性均降低，维生素E干预后，ROS活性不但没有减少，反而增加，说明BaP与维生素E联合作用时，维生素E可能不表现其抗氧化作用，反而表现一定的氧化作用，与杨杰等［10］的结论相同。此外Schneider等［11］认为，我们所理解的维生素E在人类营养、保健和疾病中所起的作用在过去20多年中已发生了转变，它既是一种抗氧化剂，还有促氧化剂的功能，甚至有非氧化剂的功能。而MDA的含量在给予BaP处理的小鼠肺泡组织中含量升高，经维生素E对抗后浓度降低，与杨杰等［10］的结论相同。

本实验进一步证实了BaP导致体内氧化应激状态改变，降低体内抗氧化酶活性并且升高了氧化物质的含量，而口服一定量的维生素E能降低其浓度并很好地提升抗氧化酶活力，而维生素E并不能降低ROS的活性，反而使其活性升高，其具体机理还有待进一步研究。维生素E这种安全可靠的保健药物的使用为今后大城市中预防空气污染物，特别对于纠正空气污染物中的氧化物质对人体氧化应激状态与免疫因子失衡有着很好的指导意义。

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