射干抗病毒口服液制备工艺的研究

贾 佳 廖 欣 王兴东 刘 慧 王曙东

南京军区南京总医院制剂科，江苏南京 210002

射干抗病毒口服液是我院正在研发的一个新制剂，该品种的开发将填补我院抗病毒类中药药物的空白，为临床提供一个有效的新制剂。射干抗病毒口服液处方由射干、金银花、佩兰、茵陈、柴胡、蒲公英、板蓝根、大青叶共8 味中药组成。经过前期研究该处方具有明确的抗病毒作用，包括呼吸道、胃肠道、角膜等部位病毒感染，也具有明显的解热、抑菌抗炎的作用，具有较好的临床疗效[1-7]。综合药材性质、有效成分的提取及工艺生产条件等因素考虑，射干抗病毒口服液选用了传统的水提醇沉法进行提取。本实验为进一步确立该口服液的制备工艺，通过正交设计试验，以绿原酸含量为指标，对制备工艺进行优化。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪，包括Waters 1525 二元泵、Waters 2996 二极管阵列检测器、Millennium 32 工作站（美国Waters公司），METTLER AE240 电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 试药

射干为鸢尾科植物射干Belamcanda chinensis（L.）DC.的干燥根茎，金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾，茵陈为菊科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.的干燥地上部分（经鉴定为绵茵陈），蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.的干燥全草，板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，大青叶为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥叶，柴胡为伞形科植物狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根（经王曙东教授鉴定为南柴胡），佩兰为菊科植物佩兰Eupatorium fortunei Turcz.的干燥地上部分。以上药材均为饮片（安徽亳州国鑫医药有限公司，批号：100608），经王曙东教授鉴定均为正品。绿原酸对照品（中国药品生物制品检验所，批号：110753-200413）；所用试液甲醇为色谱纯，其余均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

射干抗病毒口服液的制备工艺为传统的水提醇沉法，考虑到加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）、醇沉浓度（D）是影响提取效果的主要因素，因此以这4个因素作为考察对象，分别设置3个水平，以绿原酸含量为考察指标，选用L9（34）正交表，设计考察该口服液最佳水提醇沉制备工艺条件。因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

按L9（34）正交实验设计要求，按处方量的十分之一准确称取各味药材，共9份，编为1～9号。每份250 g分别置于煎煮锅中，分别加入纯化水1 000 mL（1～3号）、1 500 mL（4～6 号）、2 000 mL（7～9 号），浸泡 0.5 h 后煎煮。煎煮时间分别为 1 h（1、4、7 号），2 h（2、5、8 号），3 h（3、6、9 号）。煎煮次数分别为 1 次（1、6、8 号），2 次（2、4、9 号），3 次（3、5、7号）。煎煮液过滤，合并滤液，每份浓缩至250 mL。冷却，计算所需95%乙醇体积，边顺时针方向搅拌边加入95%乙醇，分别调节乙醇浓度至 55%（1、5、9 号），70%（2、6、7 号），85%（3、4、8 号），冷藏放置 24 h，过滤取上清液，水浴加热回收乙醇，挥去残醇，浓缩至100 mL 以下，用纯化水定容至100 mL，既得样品。

2.2 绿原酸含量的测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Lichrospher-C18 色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-磷酸二氢钠（0.78 g 加水至500 mL，用 1%磷酸溶液调 pH 至 3.4～3.6）（14∶86）；进样量：20 μL。检测波长：325 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：室温。

2.2.2 供试品的制备字体 精密吸取各工艺下的样品2 mL，加20%甲醇定容至25 mL，0.45 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品20.30 mg，至50 mL 容量瓶中，加20%甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.406 0 mg/mL 对照品储备液。精密吸取对照品储备液1.5 mL 至10 mL 容量瓶中，加20%甲醇稀释定容至刻度，作为对照品溶液。

2.2.4 测定法分别精密量取对照品溶液及供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定绿原酸含量。

2.3 结果

正交试验及方差分析情况见表2、3。

表2 正交试验结果L9（34）

表3 方差分析表

由表2（正交试验结果）直观分析表明，以绿原酸含量为测定指标，极差最大的为A 因素，其次为D、C，B 因素对结果的影响很小。提取工艺影响因素的主次顺序为A>D>C>B，即加水量>醇沉浓度>煎煮次数>煎煮时间。其中各因素最佳水平分别为 A3、B2、C3、D2， 即最优试验组合可选择A3B2C3D2，即药材加8倍量的水浸泡约0.5 h，煎煮2 h，重复煎煮3次，合并3次滤液并浓缩至适量，再调节乙醇浓度为70%。

结合表3 得知，以B 项为误差项进行方差分析，结果表明，A 因素P 值小于0.05，即加水量差异有统计学意义差异，B、C、D 差异均无统计学意义。因此，考虑到生产需要，为了节约成本及减少工时将提取次数定为2次，即确定最佳提取工艺为A3B2C2D2。即药材先以8倍量的水浸泡约0.5 h，煎煮2 h，重复煎煮2次，合并2次滤液并浓缩至适量，再调节乙醇浓度为70%。

2.4 验证试验

按正交试验得到的最佳工艺进行3次验证试验，绿原酸含量分别为：2.24、2.48、3.04 mg/mL，平均含量为 2.59 mg/mL。绿原酸含量较高。说明该工艺科学合理，质量稳定。

2.5 射干抗病毒口服液pH 值的筛选

按射干抗病毒口服液最佳工艺制备，精密量取10份药液，用10%的药用氢氧化钠水溶液或10%盐酸溶液调节pH 值，分别为 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，灌装，灭菌，考察pH 值对澄明度的影响，结果见表4。

表4 射干抗病毒口服液pH值的筛选

结果显示，在pH 值5.5～7.0 之间，射干抗病毒口服液澄明度良好。但在碱性条件下，绿原酸容易水解，故该口服液pH 值选择在5.5～6.5 之间。

3 讨论

中药材的提取工艺多种多样，有水浸泡、醇渗滤、水煎煮、醇回流等。其中水煎煮最为方便，易于工业化生产。在前期研究中表明，水提醇沉法是目前提取绿原酸常用的方法之一，能够得到较高的绿原酸含量，同时该法能够有效地控制中药口服液的澄明度。故本实验采用传统的水提醇沉法，以绿原酸含量为指标，通过正交试验设计，将该口服液的制备工艺进行了优化，考虑到大生产的成本及条件，选择A3B2C2D2为该口服液最佳制备工艺条件。

绿原酸类物质是植物在有氧呼吸过程中经桂皮酸途径（cinnamic acid pathway）所产生的一类苯丙素类化合物[8]。研究结果表明，绿原酸具有显著的药理活性，对消化系统、血液系统和生殖系统均有疗效。其水解产物咖啡酸亦有利胆、升高白细胞的作用。由于绿原酸疗效确切，现在绿原酸不但是生药的质量控制指标，也是一些成药和制剂的质量控制指标[9]。药理学研究证明绿原酸和咖啡酸是射干抗病毒口服液的有效成分，该口服液处方中的金银花、蒲公英、茵陈这3 味中药均含绿原酸，因此控制成品中绿原酸含量有重要意义。

澄明度是影响中药口服液内在质量及外观的重要因素，《中国药典》2010年版规定“中药口服液应澄清，并允许有少量摇之易散的沉淀”。中药口服液为保证有一定的澄明度，在水提醇沉去除杂质的同时应用高速离心机等。除此之外，pH 值也是影响澄明度的重要因素，本文同时考察了pH 值对射干抗病毒口服液澄明度的影响。试验证明，射干抗病毒口服液在pH 值5.5～7.0 之间，有较好的澄明度。但通过文献得知[10]，绿原酸是一种缩酚酸，稳定性差。虽然在酸性条件下，具有酚羟基结构的绿原酸以分子状态存在损失较小，但在酸性条件下绿原酸易产生沉淀。为了确保该口服液中绿原酸含量合格，该口服液pH 值选择在5.5～6.5 之间，并尽可能减少加工和储存过程中绿原酸的损失。为了提高产品中绿原酸的稳定性还可以加入合适的稳定剂[11]。

本实验采用流动相：甲醇-磷酸二氢钠（0.78 g 加水至500 mL，用1%磷酸溶液调pH 值至3.4～3.6）。此处，为了使样品峰分离度与出峰时间最优化，故把pH 值调至3.4～3.6范围内。

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