石榴皮提取物体内外抗过敏作用的实验研究

杨 成， 董 群

(皖南医学院医学微生物学与医学免疫学教研室，安徽芜湖241002)

石榴皮Pericarpiu Granati系石榴科 Punica granatum Linn．石榴属植物石榴的干燥果皮。由于石榴皮中含鞣质较多，因而石榴皮常具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗突变、抗肿瘤等多种生物学活性，但关于其鞣质是否具有抗过敏活性尚未见报道［1-3］，其它关于石榴皮免疫功能的研究报道也限于免疫调节方面［4-6］。本实验拟对石榴皮提取物抗过敏活性进行了实验，以便为深入利用石榴皮提供实验参考。

1 材料

1.1 药物与试剂 干燥石榴皮、天花粉 (购自芜湖市张恒春大药房)，息斯敏 (西安杨森制药有限公司)，透明质酸酶 (购自Sigma公司)，小鼠组胺ELISA检测试剂盒 (购自上海研生生化试剂有限公司 )，甲醇，透明质酸钾，硫酸铝等其它均为国产分析纯。

1.2 实验动物 清洁级昆明系小鼠30只，雌雄各半，体质量18～22 g，由南京医科大学实验动物中心提供［动物合格证号:SCXK(苏)2007—0001］。

2 方法

2.1 石榴皮提取物制备 500 g石榴皮于烘箱烘干，磨碎40目获得粗粉。以甲醇为提取溶剂，按质量与提取剂体积比1∶10(w/v)，4℃提取12 h过滤，滤液旋转蒸发仪45℃真空浓缩至干作为样品备用。

2.2 石榴皮体外抗过敏试验 参照文献［7］透明质酸酶体外抑制实验，测定石榴皮提取物对透明质酸的活性的抑制效应。向0.5mL酶活力单位为400 u/mL透明质酸酶中加入2.5 mmol/L CaCl20.1mL，37℃温浴20 min，加入生理盐水溶解的待测质量浓度分别为2.4、4.8、9.6、19.2、38.4 mg/mL石榴皮提取物0.5 mL、37℃温浴20 min，加入0.4 mg/mL透明质酸钾0.6mL，37℃温浴40min，加0.1mol/L NaOH 0.2 mL终止反应，冰浴10 min，加1%硼酸0.1 mL，煮沸5 min，冰浴10 min，加2mL P-DAB试剂37℃温浴20 min，585 nm下测定OD值。分别将样品、透明质酸酶替换为0.1mol/L pH4醋酸缓冲液设为对照和样品空白对照，将样品、透明质酸酶替换为醋酸缓冲液作为对照空白。

抑制率(%)=［(A－B)－(C－D)］/(A－B)×100%

A为对照管OD585;B为对照空白管OD585;C为样品OD585;D为样品空白对照管OD585。

2.3 石榴皮体内小鼠被动皮肤过敏试验

2.3.1 致敏及抗血清的制备 健康小鼠6只，体质量18～22 g，将3.75 mg天花粉溶于1.5 mL 4%氢氧化铝凝胶制备悬液脚掌注射，两只后脚掌各注入0.05 m L，共注射0.1 mL。15 d后，断头取血，离心取抗血清备用。

2.3.2 被动皮肤过敏小鼠模型的构建 参照文献 ［8］方法，取实验小鼠30只，随机分为正常组，息斯敏 (10 mg/kg)组，提取物高、中、低剂量组 (900 mg/kg，300 mg/kg，100 mg/kg)，每组6只;每天灌胃给药1次，正常组给等体积蒸馏水，连续给予7 d。取2.3.1项小鼠混合血清加生理盐水稀释成1∶5，每鼠腹壁皮内注射两个点 (相距0.2 cm)，每点0.03 mL。并再连续给药2 d，于末次给药48 h后，每只小鼠进行抗原攻击，尾静脉注射2.5mg天花粉 (用1%伊文思蓝-生理盐水配制)0.2 mL，30 min脱臼处死，眼球取血备用，翻转腹部皮肤剪下腹部蓝斑皮肤(0.5 g)，剪碎，浸泡于丙酮生理盐水溶液 (7∶3)5 mL中48 h，离心取上清液，用分光光度计610 nm波长测定吸收度，计算抑制率，评价药物的抗过敏作用。

抑制率=100%－(用药组平均光密度/致敏对照组平均光密度)×100%

2.4 血清中组胺释放水平的测定 采用酶联免疫吸附(ELISA)法试剂盒测定，严格按说明进行操作。

2.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理，数据采用均数±标准差 (± s)表示，采用F检验进行组间显著性检验;采用Pearson作相关分析，检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 石榴皮提取物体外透明质酸酶抑制抗过敏效果 按照2.2项方法测定不同终质量浓度石榴皮提取物对透明质酸酶抑制效果，结果由表1可知，当终质量浓度为2.4 mg/mL时，对透明质酸酶的抑制率为43.2%，且抑制活性与样品终质量浓度呈一定量效关系，其半数抑制质量浓度IC50为 2.69 mg/mL。

表1 提取物对透明质酸酶的抑制率

3.2 石榴皮提取物体内对小鼠被动皮肤抗过敏效果 由表2结果表明，以伊文思蓝渗透量为指标，经F分析，F=3.75，F(4，25)=2.76，组间差异具有统计学意义 (P＜0.05)，正常组与息斯敏阳性药物组、高剂量之间存在差异;息斯敏阳性药物组与低剂量组存在差异。说明与息斯敏相比，高剂量石榴皮提取物能明显地降低蓝斑皮肤浸出液光密度值，显著地抑制小鼠被动皮肤通透性，减少伊文思蓝渗透量，具有一定抗过敏活性。

表2 提取物对小鼠被动皮肤过敏反应的影响( ± s，n=6)

表2 提取物对小鼠被动皮肤过敏反应的影响( ± s，n=6)

注:与息斯敏组比较，*P＜0.05;与正常组比较，△P＜0.05。

组 别 剂量/(g·kg－1)吸光值(ODA585nm) 抑制率/%正常组 H2O 0.412±0.012 －息斯敏组 0.01 0.179±0.019△ 56.5石榴皮高剂量组 0.9 0.214±0.018△ 48.1石榴皮中剂量组 0.3 0.285±0.026 30.8石榴皮低剂量组 0.1 0.352±0.031*14.5

3.3 不同给药组别小鼠血清组胺的水平 由表3结果，经F分析，F=5.69，F(4，25)=2.76，各组间差异具有统计学意义，与正常组和息斯敏阳性药物组相比，石榴皮提取物中剂量、高剂量能显著降低实验小鼠血清中组胺浓度，尤其是高剂量，其效果均好于息斯敏阳性药物组，低剂量效果较差。结果提示，石榴皮提取物能减少过敏介质组胺的释放，具有一定的抗过敏作用。

表3 提取物对小鼠血清组胺水平的影响 ( ± s，n=6)

表3 提取物对小鼠血清组胺水平的影响 ( ± s，n=6)

注:与息斯敏组比较，*P＜0.05;与正常组比较，△P＜0.05。

组 别 剂量/(g·kg－1) 组胺/(μg·L－1)正常组 H2 O 14.3±1.04息斯敏组 0.01 10.4±0.82△石榴皮高剂量组 0.9 8.9±0.75△石榴皮中剂量组 0.3 11.2±1.40△石榴皮低剂量组 0.1 13.9±0.60*

3.4 小鼠血清组胺水平与伊文思蓝渗出量相关性分析 采用SPSS 13.0统计软件，对各组小白鼠被动皮肤过敏反应的伊文思蓝渗透量光密度与血清组胺含量二者的相关性进行统计学分析。结果散点图见图1，经Pearson相关性分析，伊文思蓝渗透量光密度与血清组胺水平在各实验组之间存在一定的相关性，P值为0.007，差异显著，具有统计学意义 (P＜0.05)，相关系数为0.48。

图1 组胺水平与伊文思蓝吸光值相关性散点图

4 讨论

现代中药关于抗过敏机制的研究多集中在过敏介质和Th1/Th2平衡理论［9-10］。而过敏反应是机体受到某些抗原刺激后出现生理功能紊乱或组织细胞损伤的异常适应性免疫应答。中医常认为对过敏症需从内调整，健脾补肾，调整机体免疫系统的紊乱，使机体整体功能得到恢复，对自然环境由不适应变为适应，如此方可达到防治的最终目的。透明质酸酶是透明质酸的特异性裂解酶，与炎症、过敏等病理症状存在明显的相关性［11］。抑制透明质酸酶的活性可使透明质酸不被分解，对维持正常的生理功能，减少过敏反应具有重要意义。而且有研究显示透明质酸酶活性和组胺之间存在明显的相关性，透明质酸酶活性的抑制实验已经作为筛选抗过敏药物的基本方法之一［12-13］。组胺是由机体肥大细胞内组氨酸脱羧基后产生的一种胺类物质，介导I型变态反应的重要生物活性介质，能引起全身毛细血管扩张、通透性增加，平滑肌痉挛。因此，机体内组胺水平的变化可作为过敏反应的检测的重要指标。

实验为提高药物净度，确保质量，利用甲醇为提取剂，经低温、真空浓缩干燥工艺，结合透明质酸酶体外抑制试验和体内小鼠皮肤通透性实验及过敏介质组胺释放量测定，分析了石榴皮甲醇提取物的抗过敏活性，结果表明石榴皮提取物具有一定的抑制透明质酸酶活性，中、高剂量能显著的阻止过敏介质组胺的释放量，高剂量是能显著降低小鼠被动皮肤对伊文思蓝渗透量，显示出一定的抗过敏活性，其活性可能与药物剂量存在一定的量效关系，也为进一步开发石榴皮提供参考。但通过何种方式抑制组胺释放有待进一步了解。通过二者之间相关性分析，可以看出，血清中组胺的水平与小鼠皮肤对伊文思蓝渗透量之间，存在一定的相关性，但相关程度不高，相关系数仅为0.48，其可能原因，一方面可能是由于实验检测样本过小;另一方面是机体能参与过敏小鼠被对伊文思蓝渗透的活性介质不仅仅只有组胺一种，如血清中如白三烯、前列腺素等多种活性介素也可能参与。

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