银杏叶提取物温度敏感型鼻用原位凝胶体外释放研究

肖金宝， 李洪斌， 刘福强， 王艳萍

(1.延边大学医学部，吉林延吉133000;2.解放军第208医院，吉林长春130062)

银杏叶制品已广泛用于治疗冠心病、心绞痛、大脑退化及脑血管疾病引起的脑功能障碍、老年痴呆等［1］。为了延长银杏叶制剂作用时间，减少用药次数、降低毒性、提高疗效，采用鼻腔给药特别治疗脑血管疾病，被认为是较为理想的给药途径。其优点有鼻黏膜内的丰富血管和高度渗透性有利于吸收，避开首过效应，吸收程度和速度可与静脉相当［2］。泊洛沙姆是温敏型原位凝胶剂的常用基质，泊洛沙姆407、188合用较常见［3］。本实验采用泊洛沙姆407、188以及壳聚糖为辅料研制了一种银杏叶鼻用原位凝胶拟用于治疗痴呆症，并对其体外释放特点进行了研究。

1 仪器与试药

LC—10AVT高效液相色谱仪、SPD—10AV紫外检测器 (日本岛津公司);N2000双道色谱工作站 (浙江大学智能信息工程研究所);AT—130柱温箱 (天津市鑫州科技有限公司);THZ—82水浴恒温振荡器 (金坛市华城创威实验仪器厂);电热恒温水浴锅 (北京市中兴伟业仪器有限公司);PHS—3C精密酸度计 (上海虹益仪器仪表有限公司);银杏叶提取物 (西安瑞安生物工程有限公司);槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品 (中国药品生物制品检定所，批号分别为100081-200406、110861-200606、110860-200407);泊洛沙姆P188、P407(南京威尔化工有限公司，批号20111101);羟丙基-β环糊精 (HP-β-CD，西安德立生物化工有限公司，批号20110805)壳聚糖(国药集团化学试剂有限公司，批号F20110316);透析袋 (直径为18 mm，相对分子质量1 000 Solarbio Life Sciences);羊、牛鼻组织(长春市皓月集团生产);甲醇为色谱纯;其余试剂均为分析纯;水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 温度敏感型原位凝胶溶液的制备

2.1.1 处方 银杏叶提取物3 g，泊洛沙姆407 7.5 g，泊洛沙姆188 10 g，壳聚糖 200 mg，30%HP-β-CD8mL，0.05%尼泊金乙酯1 mL，维生素C 0.5 g，重蒸水适量。

2.1.2 制备 依照处方，精密称取壳聚糖置已知质量的100 mL烧杯中，加入适量2%醋酸溶液搅拌溶解后，加入适量重蒸水摇匀，分别称取泊洛沙姆P407、P188依次分次加入其中，不断搅拌使溶解，4℃放置24 h直至气泡排尽即得;称取银杏叶提取物加入30%HP-β-CD溶液适量使其溶解，加入0.05%尼泊金乙酯，维生素C，搅拌使溶解，所得溶液加入到上述溶液中补重蒸水到50 g。

2.2 测定方法研究

2.2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);流动相为甲醇 －0.4%磷酸(55∶45);体积流量 0.8 mL/min;检测波长 360 nm;柱温30℃;进样量20μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品适量，加入甲醇配制成每1 mL分别含0.03mg、0.03mg、0.02 mg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 准确称取银杏叶提取物鼻用原位凝胶0.50 g，置250 mL圆底烧瓶中，加入甲醇-25%HCl(4∶1)混合液35 mL，溶解摇匀，放入90℃恒温水浴槽内回流提取1 h，取出，放冷至室温，转移至50mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声处理摇匀，提取液用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品溶 液 1.0 、2.5、4.0、5.0、5.5、7.0、7.5、8.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，在上述色谱条件进样20μL，测定。以进样量 (X)为横坐标，峰面积 (Y)为纵坐标，进行线性回归，得槲皮素回归方程Y=36 862X－33 995，r=0.999 0，线性范围3.0～25.5μg/mL;山柰素Y=41 689X－30 133，r=0.999 4，线性范围 3.0～25.5μg/mL;异鼠李素Y=37 447X－93 533，r=0.9 991，线性范围1.2～25.5μg/mL。

2.2.5 回收率测定 精密称取槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品适量，配制成质量浓度分别为0.038、0.036、0.024 mg/mL混合对照品溶液。取银杏叶提取物温度敏感型鼻用原位凝胶9份，精密称定，分别加入混合对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备。按上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果Tab.1 Recovery rate test results

2.2.6 精密度测定 精密吸取对照品溶液20μL注入液相色谱仪，连续进样5次，记录色谱图，测定峰面积，结果表明，槲皮素、山柰素、异鼠李素的RSD分别为0.42%，0.25%，0.80%。说明该方法适用于药物释放行为的考察。

2.3 人工鼻液的制备［4］精密称取磷酸二氢钾13.6 g，溶于适量重蒸水中，搅拌使其溶解，加重蒸水至1 000 mL，摇匀，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调pH为6.8。

2.4 体外药物释放行为考察 银杏叶以及制剂中主要的活性成分是黄酮类化合物和银杏叶内酯，本实验以总黄酮为研究指标进行体外释放度测定。

2.4.1 无膜溶出法［5-6］取银杏叶提取物鼻用原位凝胶制剂50mL加入到称定质量的烧杯中，把烧杯置于 (37±0.5)℃的水浴恒温振荡器中，预热20 min，使溶液完全形成凝胶。加入37℃的人工鼻液2.4 mL作为释放介质，小心操作保持凝胶表面完整。在一定频率下恒温振荡20 min，把释放介质倾倒出来，把烧杯外表面擦干，称定质量并记录，然后再放入水浴恒温振荡器中平衡20 min，依上法反复操作8次。以相邻时间点样品的质量之差为凝胶溶蚀量。以凝胶累积溶蚀百分率对时间作图，得凝胶溶蚀曲线。每一试验重复3次，结果求平均值。

将以上得到的释放介质用0.45μm微孔滤膜过滤供HPLC分析，测定药物浓度。以药物累积释放百分率对时间作图，得到药物释放曲线。重复3次，结果求平均值。见图1、2。

RSD分别为0.92%、0.85%。由图1、2可知，凝胶溶蚀量较少，药物释放比较完全，且两者的线性关系不明显 (r=0.975)，表明凝胶中的药物主要通过扩散而不是溶蚀方式释药。

图1 凝胶溶蚀曲线Fig.1 Gel dissolving curve

图2 药物释放曲线Fig.2 Drug release curve

2.4.2 牛鼻黏膜透析试验［7］牛鼻黏膜的制备［8］:将宰杀2 h内的牛鼻子取下，切开鼻腔，暴露出鼻中膈及两侧鼻甲骨，用镊子将覆盖其上的鼻腔黏膜小心剥离，用生理盐水清洗干净，将其平铺在铝箔上然后包好，－20℃冷冻储备。

采用Franz扩散池 (自制)，供给室与接收池容积均为7 mL，扩散面积为0.97 cm2。接受池内加入生理盐水，把牛鼻黏膜的黏膜层向上固定在供给室与扩散室之间，置温度 (37±0.5)℃的水浴恒温振荡器中平衡20 min，取200μL原位凝胶均匀覆盖黏膜上。分别于 15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min从接收池取样 150 μL，每次取样后补加生理盐水150μL。样品按上述色谱条件进行分析测定总黄酮的量，计算累积扩散量 (Q)。上述试验重复3次，结果求平均值，RSD为0.57%。见图3。

图3 银杏叶提取物温度敏感型鼻用原位凝胶牛鼻粘膜透析累积扩散率-时间曲线Fig.3 Time-Ginkgo biloba extract temperature-sensitive nasal in situ gel though bovinemucosal cumulative diffusion rate curve

2.4.3 羊鼻黏膜透析试验 羊鼻黏膜的制备:将宰杀2 h内的羊鼻子取下，切开鼻腔，暴露出鼻中膈及两侧鼻甲骨，用镊子将覆盖其上的鼻腔黏膜小心剥离，用生理盐水清洗干净，将其平铺在铝箔上然后包好，－20℃冷冻储备。

采用Franz扩散池 (自制)，供给室与接收池容积均为7 mL，扩散面积为0.97 cm2。接受池内加入生理盐水，把羊鼻黏膜黏膜层向上固定在供给室与扩散室之间，置于温度 (37±0.5)℃的水浴恒温振荡器中平衡20 min，用定量加样器使200μL原位凝胶均匀覆盖黏膜上。分别于15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min从接收池取样150μL，每次取样后补加生理盐水150μL。样品按上述色谱条件进行分析测定总黄酮的量，计算累积扩散量 (Q)。上述试验重复3次，结果求平均值，RSD为0.63%。见图4。

图4 银杏叶提取物温度敏感型鼻用原位凝胶羊鼻黏膜透析累积扩散率-时间曲线Fig.4 Time-Ginkgo biloba extract tem perature-sensitive nasal in situ gel though sheep mucosal cumulative diffusion rate curve

由图3、图4可知，银杏叶提取物鼻用原位凝胶透牛鼻黏膜和透羊鼻黏膜累积扩散率均已达到80%。数据分别用零级动力学方程、Higuchi方程、和一级动力学方程等数学模型拟合，以一级动力学方程拟合度最佳，相关系数 r值为0.995 3与0.996 8。结果表明银杏叶提取物鼻用原位凝胶中的药物透生物膜扩散是依赖于鼻黏膜两侧浓度梯度的被动扩散，其推动力是膜两侧的浓度梯度。根据累计扩散速率，羊鼻黏膜透析较牛鼻黏膜透析的效果好。

2.4.4 透析袋法［9］总黄酮中槲皮素、山柰素、异鼠李素的相对分子质量小于1 000D，因而选择1 000D的透析袋。取银杏叶提取物鼻用原位凝胶2 mL，加甲醇盐酸稀释液 ［甲醇-HCl(4∶1)25 mL稀释至100 mL］4 mL溶解摇匀，精密吸取1 mL置透析袋中，袋两头用线扎紧，将其浸泡在70 mL甲醇盐酸稀释液中，置于水浴恒温振荡器中，温度控制在 (37±0.5)℃，每隔一定时间点取样2 mL，然后补加相同体积的释放介质。取20μL进样供HPLC分析，测定总黄酮的量，根据公式计算累积扩散释药量，并计算累积释药百分率(Q)。上述试验重复3次，结果求平均值，RSD为1.24%。见图5。

图5 透析袋法累积释放百分率－时间曲线Fig.5 Time-the percentage of cumulative release curve of the bag filte

由图5可知，银杏叶提取物鼻用原位凝胶在6 h时释药量大于80%，同时表明银杏叶鼻用原位凝胶具有一定的缓释特征。数据分别用零级动力学方程、Higuchi方程和一级动力学方程等数学模型拟合，以一级动力学方程拟合度最佳，相关系数r为0.997 6，银杏叶鼻用原位凝胶释放符合一级释药方程。

3 讨论

泊洛沙姆由于其毒性低、刺激性小、生物相容性良好、化学性质稳定，是一种理想的药物控释载体材料［7］。但单独使用泊洛沙姆407作为基质时成凝胶温度较低，在泊洛沙姆407中加入不同量的泊洛沙姆188，可调节成凝胶温度。壳聚糖可增加黏膜通透性，从而促进药物通过黏膜的吸收。本实验还加入不同质量分数壳聚糖溶液 (0.2%、0.4%、0.6%)来考察凝胶的黏度，试验结果证明0.2%壳聚糖黏度较小，0.6%壳聚糖凝胶黏度过大，流动性差，0.4%壳聚糖为最佳;研究证实，凝胶是通过药物扩散作用进入体内而不是通过凝胶溶蚀使药物释放;通过药物累积释药百分率可以得出本凝胶剂具有一定的缓释作用;使用透析法时药物溶解性很重要，对于难溶的药物应该考虑加入增溶剂，本实验透析袋法曾使用盐水作释放介质，结果透析袋效果不好，改用甲醇盐酸稀释液，取得良好效果。

本实验利用无膜透析试验考察银杏叶提取物鼻用原位凝胶的溶蚀情况;生物膜 (牛、羊鼻黏膜)透析试验是模拟人鼻黏膜对药物的透析情况，并得到药物是通过扩散作用进入体内而不是通过凝胶溶蚀使药物释放的结论;透析袋透析试验是考察药物的相对分子质量 (大小)对进入人体的影响。

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