当归四逆汤加味防治冻疮的实验研究＊

李晓芸，龚 蓓，韩 颖，王 菲，邱 祥，干仲元，王 冰，张 彤

(上海中医药大学，上海 201203)

冻疮是一种季节性的常见病和多发病，好发于肢体的末梢和暴露的部位，如手、足、鼻尖、耳边、耳垂和面颊部[1]。中医认为，冻疮乃皮肤肌肉受严寒侵袭、气血运行不畅致气血凝滞而成，故临床治疗以温经散寒、活血化瘀、消肿止痛为主。当归四逆汤源于《伤寒论·厥阴篇》，“手足厥寒，脉细欲绝者，当归四逆汤主之”，有温养经脉、通畅血行之功，为治疗冻疮的代表方。花椒散寒除湿，与当归四逆汤同用，可助其温经通脉之力而增强疗效。因此，在尊重仲景原方基础上，选用当归四逆汤加味花椒，分别采用水煎法和渗漉法提取，结合动物试验综合评价不同提取方法制备的中药提取物预防冻疮的效果。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

RE－52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);FA2004型电子天平(上海天平仪器厂);YLS－6B型智能热板仪(山东省医学科学院设备站)。当归等药材购自上海养和堂中药饮片有限公司;硫化钠、戊巴比妥钠为化学纯，乙醇为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。SD大鼠30只(体重160～200 g，雌雄兼用)，昆明种小鼠30只(体重18～22 g，雌性)，均购自复旦大学实验动物科学部，动物许可证号SCXK(沪)2009－0019。所有受试动物饲养于上海中医药大学SPF级动物房中，饲养环境温度23～25℃，相对湿度40% ～70%，昼夜明暗交替(12 h/12 h)，自由摄食饮水。

1.2 方法

1.2.1 处方组成

当归 9 g，桂枝 9 g，赤芍 9 g，白芍 9 g，细辛 3 g，炙甘草 6 g，通草 6 g，大枣 9 g，花椒 6 g。

1.2.2 提取工艺

水煎煮法:将药材先以适量水浸润0.5 h，再加水煎煮2次，依次为处方的8倍量和6倍量水，煎煮时间依次为1.5 h和1 h，合并上述水煎液，浓缩至适当浓度(每1 g提取物相当于4.0 g生药)，冷藏备用。

渗漉提取法:将药材适当粉碎，以适量80%乙醇浸润1 h，装入渗漉筒，以80%乙醇浸泡12 h后，将8倍量的溶剂以2 mL/min速度进行渗漉操作，收集渗漉液，将药液于60℃减压浓缩至适当浓度(每1 g提取物相当于4.0 g生药)，冷藏备用。

1.2.3 药效试验

动物分组:将30只SD大鼠随机分为4组，空白组6只、模型组10只、水煎组及渗漉组各7只;将30只昆明种小鼠经镇痛试验初筛合格后随机等分为两组。

模型建立[2]:将大鼠固定于固定架上，用1%戊巴比妥钠(5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠;3～5 min后用弯剪紧贴皮肤粗略剪去背部两侧试验部位被毛，大小为直径4 cm左右的圆形区域;用8%硫化钠溶液快速蘸洗试验部位，2～3 min后待被毛溶解成糊状，用湿纱布擦洗干净;脱毛后立即用温水彻底洗净，使试验部位皮肤裸露，备用。将准备好的1元钱硬币全部浸入液氮罐中15 min，使其充分冷却至－196℃;将备好皮的大鼠放于液氮灌旁边以减少实验误差;然后取出1枚硬币。立即将其贴紧大鼠背部一侧试验部位，造成皮肤局部冻伤。硬币直径为25 mm、厚2 mm，致伤范围以此大小作为1个疮面，至伤时间8 s。

药效评价方法选择:复温第2天给药组分别于冻伤局部给予水煎、渗漉提取物(2.5 g/mg)涂擦，连续5 d。第7天采用冻疮治疗前后皮肤外观比较、抗炎－肿胀度检查法、镇痛试验法、组织切片等方法综合评价中药提取物防治冻疮的效果。

冻疮治疗前后皮肤外观描述:通过皮损处红斑大小、肿胀程度、水疱及糜烂等外观改变，评价冻疮康复情况。冻疮分度[3]，Ⅰ度为开始可有暂时渗出，色紫或青，可伴有浮肿，触之有凉冷感，此时遇暖，颜色可转为红肿，并出现瘙痒、疼痛;Ⅱ度为受冻较重，小动脉收缩时间过长，组织损伤加重，在红斑的基础上发生水疱或大疱，内容清晰，疱破后形成糜烂渗出液或结痂;Ⅲ度为受冻较重，组织坏死，形成溃疡。参考文献[4]，拟订红斑、肿胀、水疱及糜烂渗出液的记分方法。红斑，无红斑记0分，红斑直径小于1 cm记1分，1～2 cm记2分，大于2 cm记3分;肿胀，无肿胀记0分，轻微肿胀记1分，肿胀、有绷紧感记2分，肿胀明显且局部发亮记3分;水疱及糜烂，出现水疱记3分，出现糜烂记4分，渗出液较少记5分，渗出液较多、可流出记6分。

抗炎－肿胀度(称重法)[5]:大鼠处死后，剥下大块脱毛皮肤，除去皮下脂肪，摊至硬质木板上，在非冻伤处与冻伤肿胀处分别取下直径7 mm的圆形皮肤，立即称重。以两圆形皮肤质量之差作为肿胀值，计算肿胀抑制率。肿胀抑制率(%)=(模型组平均肿胀度－给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100%。

镇痛作用(热板法)[6]:取小鼠，放在加热至55℃的金属板上，以舔后足为痛反应指标，共测2次，以每次不超过30 s者为合格鼠，取平均值为给药前痛阈值。将预选合格鼠随机等分为生理盐水、水煎、渗漉3组，生理盐水组分2次给药、每次间隔1 h，水煎组与渗漉组分3次给药、每次间隔1 h，末次给药后0.5 h测定给药后痛阀值。

组织切片[7]:切取大鼠冻伤皮肤组织标本，经固定、水洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续切片、苏木精－伊红染色、中性树胶封固后，于光学显微镜下观察。主要观察不同组别皮下的水肿、血管等情况。

1.2.4 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件处理。计量数据以表示，数据符合正态性分布、方差齐性，组间比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用LSD法。校验水准α=0.05。

2 结果

2.1 皮肤外观描述

结果见表1。模型组及给药组造模后，均为Ⅱ度冻疮。治疗后模型组均结痂;水煎组及渗漉组均结痂、长毛，肿胀消退，红斑明显缩小。结果表明，大鼠冻伤后有一定的自愈能力，且水煎与渗漉提取物均有利于冻伤的恢复。

2.2 抗炎－肿胀度试验

结果见表1。结果表明，水煎与渗漉的提取物均可明显降低大鼠冻伤后皮肤的肿胀度，且水煎组的疗效好于渗漉组。

2.3 镇痛作用试验

将生理盐水组按每次每1 kg体重10 mL分2次涂于小鼠后足，水煎组与渗漉组按每次2.5 g/kg涂于小鼠后足分3次给药，末次给药后测定痛阈值。结果见表2。结果显示，水煎、渗漉提取物局部涂擦后对热板致痛小鼠有明显的镇痛作用，而水煎与渗漉提取物之间差异不明显。

表1 当归四逆汤加味对冻伤大鼠的影响(±s)

表1 当归四逆汤加味对冻伤大鼠的影响(±s)

注:与本组试验前比较，▲P＜0.01;△P＜0.05;与模型组比较，＊P ＜0.05;与水煎组比较，#P ＜0.05。

组别 外观积分(分) 肿胀度肿胀抑制率(%)治疗前 治疗后 差值 平均肿胀度模型组水煎组渗漉组72.09 34.88 2.286 ±0.951 1.857 ± 0.690 2.429 ± 0.535 1.714±0.951△1.000 ±0.577▲1.429 ±0.535▲0.571 ±0.535 0.857 ± 0.380 1.000 ± 0.218 0.043 ±0.016 0.012 ± 0.011＊0.028 ±0.008＊#

表2 当归四逆汤加味对热板致痛小鼠的镇痛作用(± s，s)

表2 当归四逆汤加味对热板致痛小鼠的镇痛作用(± s，s)

组别生理盐水组水煎组渗漉组剂量10 mL/kg 2.5 g/kg 2.5 g/kg动物数(只)10 10 10给药前后痛阈值差0.655 ± 0.734 4.359 ± 1.347＊4.170 ± 3.138＊

2.4 组织切片

分别切取空白组、模型组、水煎组及渗漉组4组大鼠冻伤皮肤组织，制作石蜡切片后，于光学显微镜下观察不同组别表皮厚度、血管等情况。结果见图1。可见，模型组表皮较厚，皮下有较多血管;水煎组及渗漉组表皮均较薄，血管明显减少，并有毛囊出现，给药后表皮肿胀消退且冻伤皮肤逐渐康复。

图1 各组给药后皮下组织的变化(×100)

3 讨论

当归四逆汤温阳与散寒并用、养血与通脉兼施，诸药相合，温、补、通三者并用，温中有补，补中兼行，一则散寒通脉，一则温补营血，使寒邪散、血脉通、阳气旺、营血充，正合阳虚血弱、寒凝血滞之病机。加味花椒，可散寒除湿，治寒湿痹痛，助当归四逆汤温阳散寒通脉之力，扶正祛邪，标本兼顾。《伤寒论》中当归四逆汤原方的剂量比例为当归∶桂枝∶芍药∶细辛∶炙甘草∶通草为3∶3∶3∶3∶2∶2。目前，临床上芍药多用白芍，取白芍酸甘、滋养阴血之功，但在东汉时期，芍药不分白芍、赤芍，且赤芍有活血通经、祛瘀止痛之效，故本试验同用白芍与赤芍。细辛辛温行散、散寒止痛，有小毒，故临床使用有“细辛不过钱”之说，即不超过3 g。考虑当归、桂枝、芍药等药的临床常用剂量，本试验的处方剂量确定为当归 9 g，桂枝 9 g，赤芍 9 g，白芍 9 g，细辛 3 g，炙甘草 6 g，通草6 g，大枣 9 g，花椒 6 g。

现代药理研究表明，当归四逆汤灌胃对酒石酸锑钾所致小鼠扭体反应和电刺激致痛嘶叫反应均有显著抑制作用，对巴豆油所致小鼠耳廓肿胀和角叉莱胶所致大鼠足跖肿胀均有抗炎消肿作用[8];当归四逆汤还有显著的活血化瘀作用[9]。花椒挥发油有抗炎、镇痛作用[10];花椒毒酚能显著提高热板法致痛小鼠的痛阀值，具有镇痛作用[11]。因此，当归四逆汤和花椒均有较好的抗炎、镇痛及活血化瘀作用，在当归四逆汤基础上加味花椒，功能温中止痛、散寒除湿，更有利于冻疮的防治。

本试验结果显示，水煎与渗漉提取物均有利于冻伤的恢复，水煎提取物的抗炎消肿效果好于渗漉提取物，而两者的镇痛作用无明显差异，表明当归四逆汤加味花椒的水溶性及脂溶性成分均有较好的镇痛效果;组织切片显示，水煎组及渗漉组给药后皮下组织内血管较模型组明显减少，且渗漉组效果较显著。因此，在当归四逆汤加味花椒用于防治冻疮的药效学研究中，应综合考虑水溶性和脂溶性成分的协同作用，还应进一步考察给药后血液流变学特性，即检测全血黏度、血浆黏度、血细胞比容、红细胞聚集指数及红细胞变形指数等指标的变化。

致谢:本文的试验研究工作得到了上海中医药大学教学实验中心的黄景斌、郭春荣、浦益琼等老师的悉心指导和热忱帮助，在此谨致谢意。

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