气滞血瘀证大鼠NO/NOS体系的变化

宁天一 王婷婷 姜 静 程嘉艺

(辽宁中医药大学，沈阳，110032)

气滞血瘀证是指气机阻滞而致血行瘀阻所表现的证候。常因情志不遂，闪挫外伤或寒邪内阻等所引起。临床表现胸胁胀满或走窜疼痛，性情急躁，胁下痞块，刺痛拒按，入夜更甚，或妇女痛经，经色紫暗，夹有瘀块，舌紫暗或有瘀斑等。气是人体内至精至微的生命物质，是生命活动的重要物质基础，具有推动血液的生成、运行，以及津液的生成、输布和排泄等功能。中医“气”的概念较难把握，但“气”毕竟是物质的，有其物质基础才能完成其重要功能。为了初步探讨 “气”的本质与气体信号分子的相关性，本实验复制气滞血瘀病症模型，观察其模型体内气体信号分子NO的变化情况，研究是否与中医理论中的“气”存在相关性，为血瘀证及活血化瘀方药的研究提供一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂 NO试剂盒(20111123)、NOS试剂盒(20111123)(南京建成生物工程研究所)，Trizol(D9108A)、RT－PCR试剂盒(DRR019A)、琼脂糖(D601)、Marker(D526A)引物(宝生物工程(大连)有限公司)。

1.2 实验动物与分组 SPF级健康wistar大鼠，雌雄各半，体重180g～200g，随机分成4组，分别为对照组、模型组、血府逐瘀汤低剂量组和高剂量组。

1.3 复制模型 采用多因素联合刺激法造模［1］。刺激因素包括声、光、电、冰水浴、束缚、夹尾，每天刺激2次，持续5周时间。

1.4 血浆NO含量测定 NO产生后在体内迅速转化亚硝酸盐(NO2－)和硝酸盐(NO3－)，而 NO2－又进一步转化为NO3－。利用硝酸还原酶特异性地将NO3－还原NO2－，通过显色深浅测定 NO2－浓度高低［2］。

1.5 肝组织TNOS和iNOS活性测定 按NO和NOS检测试剂盒说明书操作，测定NO合酶(TNOS)、诱导型NO合酶(iNOS)活性，结构型NO合酶(cNOS)活性=TNOS活性－iNOS活性。

1.6 RT－PCR法测定肝组织eNOS基因表达 参照文献［3－4］采用 Trizol试剂提取总 RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA，以此为模板进行PCR扩增。反应条件eNOS、β－actin退火温度65℃。采用凝胶成像分析仪扫描，测定目的基因和β－actin扩增的A，计算其与β－actin的比值，见表1。

表1 eNOS和肌动蛋白基因引物序列

1.7 颈总动脉eNOS免疫组织化学分析 颈总动脉石蜡切片常规脱蜡水化，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶15min，微波法抗原修复10min，滴加一抗，4℃过夜，次日顺序加入二抗和三抗，分别 37℃孵育30min，DAB显色，苏木精复染，光镜下观察eNOS在颈总动脉内皮细胞中表达情况［5］。用彩色病理分析系统测定eNOS阳性细胞的着色灰阶值。灰阶值越小，说明着色越深，反映eNOS表达量越多，以灰阶值来进行量化后行统计学分析。

2 结果

2.1 血浆和肝组织NO含量及肝组织中酶活性检测与对照组相比，模型组血浆和肝组织中NO含量明显降低(P＜0.01)，低剂量组血浆及肝组织中NO含量明显高于模型组(P＜0.05)。与对照组相比，模型组TNOS、cNOS活性均明显降低(P＜0.01)，低剂量组TNOS、cNOS活性明显高于模型组(P＜0.05)，见表2。

2.2 肝组织eNOS基因表达 肝组织eNOS基因表达水平:与正常对照组相比，模型组肝组织eNOS基因表达水平明显降低(P＜0.01)，低剂量组肝组织eNOS基因表达水平明显高于模型组(P＜0.05)，见图1。

表2 气滞血瘀证大鼠血浆及肝脏中NO含量及酶活性的变化(n=8，s)

表2 气滞血瘀证大鼠血浆及肝脏中NO含量及酶活性的变化(n=8，s)

注:与对照组比较，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01，△△P ＜0.05。

分组 剂量(生药量/kg)血中NO(μmol/L)肝组织NO(μmol/mg)TNOS酶活性(U/mg)cNOS酶活性(U/mg)2.77±1.73 5.87±1.72 0.31±0.04 0.19±0.04模型组 0.52±0.33＊＊ 0.52±0.24＊＊ 0.19±0.02＊＊ 0.04±0.01＊＊低浓度 15 2.37±0.53△△ 3.72±1.53△△ 0.24±0.02△△ 0.10±0.04△高浓度 15 1.88±1.04 2.26±1.28 0.22±0.02△△对照组0.04±0.05

图1 大鼠肝组织中NOS基因表

2.3 颈总动脉eNOS免疫观察 与对照组比较模型组颈总动脉eNOS灰阶值明显升高(P＜0.05)，与模型组比较低剂量组颈总动脉eNOS灰阶值明显降低(P＜0.05，见表3、图2。

图2 大鼠颈总动脉内皮细胞NOS(×200)

表3 气滞血瘀大鼠肝组织eNOS蛋白表达(n=6，s)

表3 气滞血瘀大鼠肝组织eNOS蛋白表达(n=6，s)

注:与对照组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05。

0.18±0.01模型组 6 0.27±0.03＊＊低剂量组 6 15 0.21±0.07△高剂量组灰阶值对照组组别 鼠数(只)剂量(mL/kg)6 15 0.22±0.05 6

3 讨论

一氧化氮是一种化学性质比较活泼的亲脂性小分子化合物，在生物体内由左旋精氨酸在NOS作用下最终生成，能够持续产生并透过生物膜自由扩散，具有舒张血管，降低血压等生理功能，在心血管系统、免疫系统和神经系统中起着重要的作用［6］。临床上应用硝基类舒血管药物已有一百多年，随着研究的深入，人们了解其作用机制，实际上是作为NO供体。硝基类舒血管药物引起的血管舒张作用直接取决于NO的生成量，并存在量效关系，对血瘀证有治疗作用的硝基类舒血管药物本质是通过气体信号分子发挥作用［7］。气滞血瘀证的形成是一个比较漫长的过程，与情绪、饮食、年龄、环境、疾病等诸多因素有关。中医认为精神情志活动是以脏腑所化生和贮藏的精气血为物质基础，而肝主疏泄在志为怒，怒以肝藏血为物质基础，肝贮藏血液、调节血流量及防止出血有赖于肝疏泄气机得以实现。本试验中大鼠经多因素联合刺激致使情志发生改变，长期处于暴怒状态，从而建立了气滞血瘀模型。实验结果显示气滞血瘀证NO含量和NOS表达水平明显降低(P＜0.01)，给予行气活血药后NO含量和NOS表达水平显著性增加(P＜0.01)，二者变化趋势一致，这也验证了NO舒张血管功能，研究揭示行气活血药可以上调NO/NOS体系。有研究表明［8］机体组织缺血再灌注后内皮功能受损，组织细胞会形成不可逆性损伤，组织缺血后eNOS活性、eNOS基因表达水平和NO含量均明显降低，缺血组织恢复灌注后，eNOS活性、eNOS基因表达水平和NO含量低于基础值，恢复灌注2 h，上述指标接近基础值，这是机体自我保护的一个过程。中医理论中“气”是存在于人体内的至精至微的生命物，是生命活动的重要物质基础，具有很强的活力，能够推动血液的生成、运行，以及津液的生成、输布和排泄等作用，存在生命物质和生理功能双重属性。中医关于“气为血之帅，血为气之母，气行则血行，气滞则血瘀”的论述，反映了气血在生理病理方面的相互作用和相互致病的密切关系。进一步深入探讨气的本质和气血关系，可以为治疗血瘀证提供新的途径，将对中西医结合血瘀证的研究具有重要的意义。

［1］王婷婷，贾乘，陈宇，等.大鼠气滞血瘀证模型的建立及影响因素分析［J］.中国中药杂志，2012，37(10):1692 －1633.

［2］董燕，李萍.酶还原法测定血清中一氧化氮浓度［J］.宁波医学，2000，12(9):434 －435.

［3］李吉和，仝东霞，徐新兵，等.内毒素休克大鼠心肌组织中H_2S/CSE体系的变化及意义［J］.哈尔滨医科大学学报，2011，45(3):235－239.

［4］李荣娜，曾翔俊，陈玉涵，等.气体信号分子硫化氢和一氧化氮在代谢综合征大鼠心脏保护中的相互作用［J］.中国医学科学院学报，2011，33(1):25 －32.

［5］宋丽秀，郑勇，陈卫刚，等.大鼠肝硬化形成中气体信号分子一氧化氮、一氧化碳对硫化氢/胱硫醚－γ－裂解酶体系的影响［J］.现代生物医学进展，2010，10(7):1213 －1216.

［6］金红芳，杜军保，唐朝枢.气体信号分子在心血管疾病发病中的意义［J］.中国医学科学院学报，2005，27(4):518 －524.

［7］谷万里，史载祥.气体信号分子与活血化瘀研究［J］.中国中西医结合杂志，2006，26(3):262 －265.

［8］沈毅弘，王雪芬，周建英，等.一氧化氮合酶在心肌缺血再灌注过程中的动态变化［J］.浙江预防医学，2003，15(6):10 －11.