荧光定量PCR法检测线粒体基因A1555G与C1494T突变

林文津 郭舜民 徐榕青 肖志勇 张亚敏

1.福建省医学科学研究院 福建省医学测试重点实验室，福建福州 350001；2.福建省福州市第二医院，福建福州 350007

线粒体12SrRNA基因是氨基糖苷类抗生素导致的非综合征型听力损失的一个突变热点区域。由于A1555G和C1494T突变在12SrRNA基因形成G-C和U-A配对使得与氨基糖苷类抗生素的结合更加容易，这就是为何携带这些突变的人在接触了氨基糖苷类抗生素时会出现或加重耳聋的原因[1]。因此，对这两个点突变的检测，对于预防氨基糖苷类抗生素中毒性耳聋有着重要的临床意义。目前关于线粒体耳聋基因的检测方法有多种，文献已报道的方法有酶切法[2-3]、直接测序法[2-6]、基因芯片法[7-10]、实时荧光定量Taqman探针法[11]等。检测的突变热点主要是1555、1494、961等[12-13]。本次试验采用荧光定量PCR法检测95例非综合征药源性耳聋患者及其家属线粒体基因A1555G、C1494T突变，并采用传统的毛细管电泳测序法进行确证，现将检测结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

95例非综合征型耳聋患者及其家属均为汉族，其中，男44例 女51例，聋病先证者54例（男39例，女15例）。经知情同意后，首先对先证者及其家属进行病史调查，包括家族史、耳聋史及耳毒性药物的使用情况等，同时进行纯音听域测试，明确先证者均为非综合征型耳聋。

1.2 仪器与试剂

PCR扩增仪（Bio-Rad公司）；ABI 3130测序仪、ABI 7500荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems）。Taq酶、dNTP（北京百泰克生物技术有限公司）；测序引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）；药物性耳聋基因突变检测试剂盒及阳性对照试剂（智海生物工程北京有限公司）。

1.3 全血基因组DNA提取

用枸橼酸钠抗凝的一次性采血管，取受检者的外周静脉血约2 mL，采用离心吸附柱法按照血液基因组DNA提取试剂盒的操作说明书操作，提取受检者全血基因组DNA，用琼脂糖凝胶（1%）电泳检测。所提取的DNA条带清晰，完整性好，紫外分光光度计检测DNA 浓度约为 50 ng/μL。

1.4 荧光定量PCR检测

取出试剂盒中扩增反应液，解冻后取18 μL，再加入2 μL提取得到的DNA或对照品溶液，混匀，然后上机进行检测。温度循环程序分4个步骤：①37℃5 min，1 个循环；②95℃ 15 min，1 个循环；③95℃ 15 s，54℃ 20 s，72℃ 20 s，40 个循环；④95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 15s，60℃ 15 s，1 个循环，进行熔解曲线分析。

1.5 mtDNA测序

1.5.1 PCR反应 PCR引物根据从 NCBI下载的人线粒体基因组序列，利用Gene Tools软件自行设计，所设计引物的PCR产物为线粒体1262～1772位点，共计511 bp，能同时检测1494与1555位点的突变。PCR反应体系见表1。PCR程序：①94℃ 5 min，1个循环；②94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32 个循环；③72℃ 10 min，1 个循环。

表1 PCR反应体系

1.5.2 测序 将PCR产物经常规方法制备成测序模板后用传统的双脱氧链终止法在ABI 3130测序仪上测序分析。

2 结果

2.1 荧光定量PCR检测结果

除空白对照组外，各反应管均出现特异性扩增，各PCR产物的Tm值之间均能很好的进行区分（大于2℃），1494T 标准对照管出现 78.2℃和 84.5℃的熔解峰，分别为1494T和质控峰（图1A）；1555G标准对照管主要出现74.9℃和84.1℃的熔解峰，分别为1555G和质控峰（图 1B）；1555G阳性患者出现 75.7℃和84.8℃的熔解峰，分别为 1555G 和质控峰（图 1C）；正常人仅出现1个84.2℃的熔解峰，为质控峰（图1D）；以无菌双蒸水为模板的空白对照为一直线，未见熔解峰（图1E）。综合上述检测结果，可以判定在75℃附近出现熔解峰，说明有A1555G突变，在78℃出现熔解峰，说明有C1494T突变，正常人仅在84℃附近出现熔解峰。

根据上述判定方法，本试验共发现4例A1555G突变患者，占先证者7.41%，占高危人群（先证者及其家属）4.26%，未发现C1494T突变患者，见表2。采用PASWSTAT统计软件，经交叉表McNemar检验分析，P=1.000，说明两种方法检测效果相同。

图1 荧光定量PCR法检测的熔解曲线图

表2 荧光定量PCR法与测序法检测结果比较（例）

2.2 线粒体基因序列分析

运用GeneTools软件将测序结果与NCBI网站上公布的人线粒体基因标准序列比对，结果显示仅这4例阳性患者线粒体基因发生了线粒体基因 A1555G突变。所有检测结果均与所测标本的真实结果一致，从而验证了本方法是准确有效的。结果提示，线粒体基因A1555G突变可能是这4例患者非综合征耳聋遗传易感性的分子基础。查阅患者病例资料发现，该4例A1555G阳性患者双耳均出现了不同程度的听力损伤，且均为女性，其中两位为母女关系，这也从侧面反映了药源性耳聋这一线粒体病呈现出母系遗传的特点。

3 讨论

氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素等，因其对革兰阴性菌的感染特别有效，同时对于某些革兰阳性菌也有协同抗菌作用，在临床上仍在广泛使用。此外，疫苗是另一个潜在的危险因素，大多数人并不知道疫苗中含有氨基糖苷类抗生素，如国家计划免疫的麻疹疫苗中含有新霉素，水痘疫苗中含有新霉素，甲流疫苗中含有硫酸庆大霉素。线粒体基因突变与药源性耳聋的关系研究的比较清楚，突变携带者就是药源性耳聋的敏感个体。药源性耳聋尚无有效治疗方法，唯一的办法就是预防。通过基因检测，发现基因突变的携带者，尽早干预，可以预防药源性耳聋的发生。

本试验采用特异引物延伸技术结合实时荧光定量PCR技术，通过PCR产物Tm值的差异来实现多位点突变的检测，当有突变型核酸存在的情况下，针对突变型设计的序列特异性引物得到延伸产生特定的PCR产物，同时在每个反应体系中加入了荧光物质，扩增完成后，荧光物质结合到PCR产物中，在进行熔解曲线分析后，不同的PCR产物将产生不同的熔解峰（即熔解峰所对应的温度值不同），从而达到一个反应同时检测两个突变的结果。所购买的试剂盒中未提供阳性对照，由该公司另行提供。为方便判断C1494T和A1555G突变的熔解峰峰位，本试验将2个阳性标准对照分别检测，发现1555G突变熔解峰出现在75℃，1494T突变熔解峰出现在78℃；结果图1B中1555G熔解曲线除了出现特异性产物熔解峰外还出现了较多的杂峰，可能与该公司提供的标准对照浓度太低有关，但不影响实验结果的判定。

对药源性耳聋基因突变的检测方法，除本实验应用的方法外，还有直接测序法、实时荧光定量Taqman探针法、耳聋基因芯片法、酶切法等。直接测序法虽然是鉴定突变的金标准，但操作繁琐、需专门的培训，结果判读复杂。Taqman探针法与本方法比较，虽然用的均为荧光定量PCR仪，但本法能在一管中实现两个位点的检测，成本低廉、结果判读容易。目前芯片方法需要1次同时检测9个常见耳聋基因突变位点，成本较高，不适合单独针对药源性耳聋患者的临床筛查。酶切法虽然不需要用到荧光定量PCR仪，但操作较复杂，特异性差，需跑电泳（电泳胶需要额外配制，而且含致癌物质），容易污染。本实验仪器要求简单，费用低，操作简单，无需酶切或电泳，同时整个过程除加入模板外无需进行开盖操作，有效避免污染的产生，能够简单、快速、准确的实现2个点突变的同时检测或单独检测。

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