中风膏对大鼠脑缺血再灌注损伤脑梗死体积及细胞凋亡的影响1）

刘志军，杨瑞龙，杨 涛，胡敏棣，窦友义，张 谦，赵俊喜

中风膏是在古方“佛手散（当归、川芎）”基础上重用岷当归（达药典规定的6倍），配伍赤芍、黄芪、水蛭、羌活和甘草等制成，具有活血化瘀及调节免疫功能的作用［1］，对中风有良好临床疗效［2，3］。本研究旨在探讨中风膏对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及抗凋亡机制。

1 材料与方法

1.1 动物、药品和主要试剂 健康雌雄各半SPF级SD大鼠140只，体重280g～320g，鼠龄3～4个月。购于甘肃中医学院科研实验中心，许可证号：SCXK（甘）2004－0006。

中风膏为甘肃省中医医院院内制剂，由医院制剂室提供。药品批文号：甘药制字Z04000839，生产批号：20090412。配方：岷当归、川芎、赤芍、黄芪、水蛭、羌活、甘草等。工艺：将岷当归精馏后，取当归药渣与川芎、赤芍、黄芪、水蛭、羌活、甘草混合，经水提、醇沉、过滤、浓缩后与当归精馏产生的挥发油混合，灭菌制成膏剂，成品包装。规格：10g。每克相当于生药9g（依据中华人民共和国药典2000年版）。

脱氧核苷酸末端转移酶介导的DNA原位末端标记法（TUNEL），原位细胞凋亡检测成套试剂盒由德国罗氏公司提供。2，3，5－三苯基四氮唑（TTC）由武汉博士德生物科技有限公司提供。

1.2 动物分组及处理 用数字表法将大鼠随机分为假手术组（15只），模型组、中风膏大剂量组、中风膏小剂量组，各35只。除假手术组外，各组又分为TTC染色组及凋亡检测组，TTC染色组再随机分为缺血再灌注24h、48h及72h3个时间点，凋亡组随机分为缺血再灌注4h、24h、48h和72h4个时间点，各个时间点5只。

给药方法：中风膏大、小剂量分别为1.8g／（kg·d）和0.9 g／（kg·d）。造模前连续灌胃7d及再灌注1h后灌胃给药，每天上午、下午各一次；模型组每次予以同等容积生理盐水灌胃。1.3 造模方法 参照Longa等［4］线栓造模方法并进行部分改良建立大鼠右侧脑缺血再灌注模型。手术分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），结扎并切断颈外动脉及其分支，电凝烧灼颈内动脉颅外分支翼腭动脉，以阻断颅外来源的侧支循环。

动物模型成功的评价标准：手术后以大鼠清醒后出现同侧Honer征（梗死灶同侧瞳孔缩小，眼裂变，眼球内陷）、自主运动无方向性、提尾向右侧旋转、自行向右转圈为判断模型成功的标准。淘汰的大鼠随机补充，保证每组5只。

1.4 标本取材

1.4.1 TTC染色组大鼠脑标本取材 脑缺血2h再灌注24h、48h、72h各时间点用10%水合氯醛（350mg／kg）麻醉大鼠后，沿胸骨旁线剪开胸腹腔，暴露心脏、肝脏及主动脉起始端，取灌注针自心尖向右上45度进针至主动脉起始端，固定针头，剪开右心耳，快速灌注生理盐水（200～250）mL至肝脏变白，自右心耳流出的液体清亮后接着灌注4%多聚甲醛约300mL，先快后慢，至大鼠四肢强直僵硬后停止灌注，拔出穿刺针。快速断头取脑，置于10%多聚甲醛室温下固定保存。

1.4.2 凋亡组大鼠大脑标本取材 脑缺血2h再灌注4h、24 h、48h、72h各时间点用10%水合氯醛（350mg／kg）麻醉大鼠。打开胸腔，从左心室插入注射针头，于右心耳部处剪一小口，向内先快速滴入生理盐水10min，然后缓慢滴入，至右心耳流出液变清亮，肝脏颜色变白为止。然后注入4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液约250mL，灌流固定约30min，至肝脏变硬。用大剪刀沿大鼠颈部断头取脑，除去小脑和脑干，取视交叉前后20mm～30mm冠状切片，放入10%甲醛中固定，24h内石蜡包埋。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 神经功能缺损评分 参照 Longa［4］和 Bederon［5］的5分制评分方法标准，在缺血再灌注各时间点进行神经功能缺损评分。

1.5.2 TTC染色检测脑梗死体积 将所取大脑置于－20℃冰箱中速冻20min，距额极3mm将大脑作连续2mm冠状切片，共6片，然后将脑片放入2%TTC磷酸盐缓冲液中，37℃恒温孵育1h，转入4%多聚甲醛中6h后观察。应用病理图像分析仪测量脑梗死面积，根据公式 V＝（A1＋…An）t／2算出梗死体积。其中V为梗死体积，A为梗死面积，t为切片厚度。

1.5.3 脱氧核苷酸末端转移酶介导的DNA原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡 将石蜡包埋标本行连续冠状切片，厚3μm，每20片取一片检测细胞凋亡。光镜下阳性细胞核染成棕黄色。每张切片在400倍光镜下随机选取5个不重叠的视野，计算阳性细胞数取平均值。

2 结 果

2.1 中风膏对大鼠神经功能缺损评分的影响 假手术组大鼠没有神经功能缺损表现，评分均为0分。模型组、中风膏大小剂量组均出现了不同程度的神经功能缺损症状，神经功能缺损评分随时间推移而逐渐降低。在缺血再灌注24h后，药物组神经功能缺损评分均小于模型组（P＜0.05），但中风膏大、小剂量组间差异不明显。详见表1。

表1 各组大鼠再灌注各时间点神经缺损评分比较（±s） 分

表1 各组大鼠再灌注各时间点神经缺损评分比较（±s） 分

组别 4h（n＝5） 24h（n＝10） 48h（n＝10） 72h（n＝10）假手术组0000模型组 2.56±0.55 2.78±0.63 2.12±0.73 1.57±0.68中风膏小剂量组 2.54±0.57 1.98±0.551） 1.56±0.591） 0.93±0.521）中风膏大剂量组 2.48±0.34 1.80±0.591） 1.44±0.521） 0.88±0.561）在相同时间点，与模型组组比较，1）P＜0.05

2.2 中风膏对脑梗死体积的影响 假手术组无梗死灶。模型组随缺血再灌注时间延长，脑梗死体积逐渐增加。缺血再灌注24h、48h、72h时间点，药物组梗死体积均小于模型组（P＜0.05），但中风膏大、小剂量间差异不明显。详见表2。

表2 各组大鼠再灌注各时间点脑梗死体积比较（±s） cm3

表2 各组大鼠再灌注各时间点脑梗死体积比较（±s） cm3

组别 n 24h 48h 72h假手术组5 0 0 0模型组 5 0.123 9±0.023 0 0.125 4±0.020 7 0.130 1±0.029 9中风膏小剂量组 5 0.078 6±0.033 91） 0.073 2±0.021 71） 0.071 3±0.015 31）中风膏大剂量组 5 0.073 5±0.037 11） 0.071 4±0.022 11） 0.066 1±0.020 91）在相同时间点，与模型组组比较，1）P＜0.05

2.3 中风膏对细胞凋亡的影响 光镜下正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核为深浅不一的棕褐色。TUNEL法染色阳性的凋亡细胞主要位于额顶皮质梗死灶与正常脑组织交界的周边区。在假手术组凋亡细胞很少，药物组和模型组凋亡细胞均显著高于假手术组（P＜0.01）；缺血再灌注4h，凋亡细胞开始增多，24h达高峰，之后逐渐减少。药物组与模型组相比，再灌注24h凋亡细胞明显下降，并持续到再灌注72h（P＜0.05）。中风膏大、小剂量组比较无明显差异。详见表3。

表3 各组大鼠再灌注各时间点凋亡细胞数比较（±s） 个／400倍视野

表3 各组大鼠再灌注各时间点凋亡细胞数比较（±s） 个／400倍视野

组别 n 4h 24h 48h 72h假手术组5 2.0±0.28 3.5±0.35 2.5±0.31 1.5±0.28模型组 5 7.6±0.421） 16.3±0.931） 12.7±0.671） 11.7±0.571）中风膏小剂量组 5 7.4±0.401） 12.4±0.721）2） 9.5±0.731）2） 8.1±0.621）2）中风膏大剂量组 5 7.3±0.451） 11.9±0.621）2） 8.8±0.621）2） 7.5±0.481）2）在相同时间点，与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05

3 讨 论

急性脑缺血后由于脑组织缺血缺氧，产生一系列神经功能缺损症状，严重影响患者的生存质量，甚至生命。根据神经功能缺损症状评分，可准确评价药物治疗的效果及判断患者的转归。因此，神经功能缺损评分无论在临床及动物实验中，被广泛采用。Longa和Bederon的5分制评分方法是公认的大鼠MACO模型神经功能缺损症状评分方法。本研究假手术组仅仅将线栓插入大鼠颈内动脉6mm，并未达到引起缺血的深度，所以没有出现相应的神经症状，神经学评分为0分，从而排除了手术因素对大鼠神经学评分的影响。研究结果表明药物分组因素、时间因素对大鼠的神经学评分都能产生显著的干预作用，模型组和给药组（中风膏大、小剂量组）出现了不同程度的神经功能缺损症状，神经功能缺损评分随时间推移而逐渐降低。中风膏能够改善脑缺血再灌注大鼠的神经损伤症状，在缺血再灌注24h后，给药组神经功能缺损评分均小于模型组（P＜0.05），但未显示出量效关系。应用MACO模型和TTC染色观察脑梗死体积，是目前国内外研究脑缺血再灌注损伤病理机制和评估药效的常用方法。本研究结果显示，假手术组无梗死灶；缺血再灌注24h、48h、72h时间点，药物组梗死体积均小于模型组（P＜0.05），但未显示出量效关系。中风膏对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用。

在脑缺血急性期，神经元坏死与凋亡并存，细胞坏死位于缺血中心区，细胞凋亡主要出现在缺血半暗带。而在脑缺血的迟发性神经元死亡期，则以细胞凋亡为主。凋亡可能决定了最终梗死体积［6］。本研究结果显示，凋亡细胞主要位于梗死灶与正常脑组织交界的周边区。在假手术组凋亡细胞很少，缺血再灌注模型组凋亡细胞显著高于假手术组（P＜0.05）；缺血再灌注4h，凋亡细胞开始增多，24h达高峰，之后逐渐减少。提示中风膏通过抑制缺血再灌注大鼠脑缺血区细胞凋亡，起到脑保护作用。

本实验更为全面深入阐明了中风膏神经保护作用及机制。但对其量效关系没有明确的结论。另外，中风膏抗凋亡路径尚不清楚，这些问题需进一步研究。

［1］黄正良，崔祝梅，任远，等.中风膏的血液流变学与免疫功能的研究［J］.中成药，1992，14（11）：31－33.

［2］夏永潮，徐文科，李妍怡，等.中风膏治疗中风病临床研究［J］.北京中医学院学报，1993，16（5）：38－40.

［3］杨涛，刘志军，李妍怡，等.中风膏治疗缺血性中风的临床研究［J］.中国中医药信息，2008，15（4）：80－84.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without cranietomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［5］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，etal.Rat middle cerebralartery occlusion：Evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472－476.

［6］Faubel S，Edelstein CL.Caspases as drug targets in ischemic organ injury［J］.Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord，2005，5（3）：269－287.